实验室手册-第10章
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t值约为2。
P。Q P。Q t（2）PQ
N=———— =—————— =——————
（S。E。）（2） （d/t）（2） d（2）
令d=0。1P
2（）PQ 4PQ Q
N=———————— =———————— =400X——
（0。1P）（） 0。02P（） P
2、 若容许误差d=0。15P；则
Q
N=178X——
P
3、 若容许误差d=0。20P；则
N=100XQ/P
4、 抽样调查肿瘤或其它发病率很低的疾病时，样本大小可参考Poisson分布期望可信限表。
（二） 病例对照研究（case…control study），又称回顾性研究（retrospective studies），研究样本大小可按下列分式计算。
N=————————————
Ka与Kb分别为a与b时正态分位数。可以队表中查得。
P1和P2分别为估计 对照组与病例组有暴露史的比例。
Q1=1…P1， Q2=1…P2
P=（P1＋P2）/2，Q=1…P
另，病例的暴露史可用下列公式估计：
P2=（ORXP1）/（1…P1＋ORXP1）
OR为比值比。
附表 正态分布的分位数表
KA（ 单侧检验）
KC（单侧和双侧检验） Kb（双侧检验）
3。090
2。878
2。576
2。326
2。058
1。960
1。645
1。282 3。290
3。090
2。807
2。576
2。326
2。242
1。960
1。645
（三） 队列研究（cohort study）；又称前瞻性研究（prospective studies）。研究样本大小可用下列公式计算：
但这里P1为暴露组的发病率，P0为非暴露组的发病率。
Q1=1…P0 ， Q0=1…P0
P=（P0＋P1）/2， Q=1…P
如已知P0与估计某相对危险度（R），则
P1=RP0
（四） 实验研究
1、 对于发病率在5％以上的疾病作实验研究时，两组需要的动物数（N1及N2）可用下列公式计算：
可信限为95％。T值为1。96按2计算。式中P1为对照组的预期发病率，q1=1…p1；p2为实验组的预期发病率， q2=1…p2；N1为对照组需要的观察数。
设N1=N2，上式中仅N为未知，将p、q值分别代入公式即可得N值。
2、 对于发病率在5％以下，尤其是在1％以下的低发病率疾病的调查研究时，常采用泊松分布来推导样本数。
四、试验动物数的多少，除用上述公式计算和查表外，还应考虑以下几个因素：
1、 疾病的罹患率高低。
2、 实验措施有效率的高低。
3、 要求实验精确度的高低。
4、 要求实验组和对照组差异显著性的程度。
5、 两组的均衡性即齐同必的好坏。
6、 实验分组越多，则样本世纪数就需要增长率大。
五、 实验动物的分组必须考虑各组中动物的齐同性、随机性、重复性等，尽量减少实验田的偏差。实验动物的随机性分组方法详细参阅有关书籍，常见方法有完全随机设计、配对设计、随机单位组设计和拉丁方法设计和正交设计等。
六、 实验中必须设立严格合理的对照。通过对照组可取得研究指标的数据差异、清除被试因素以外的其它因素对结果的影响等。
七、 使用实验动物务必记住节约二字，需要什么样的动物园就使用什么样的动物园，不要越级使用。在周密的设计和论证的基础上，再提出实验田动物的订购计划。
八、 正式实验之前的充分准备工作可以起到事半功倍的效果，通常预试期可以达到下列目的：
1、 使试验动物园习惯于试验期的环境条件。
2、 做好试验动物的长势、驱虫、防疫注射等项准备工作以及对它们的健康观察。
3、 训练试验人员，熟练掌握操作规程。
4、 考核试验设计是否恰当和切实可行，发现部题及时纠正。
5、 通过预试期得到统计数据，对试验动物进一步审查、调整。一般要求预试期试验动物园头数应多于正式试验的头数；预试期的长短可因试验要求而定，一般为15——20天。
九、 实验结果必须进行统计分析。
十、 几个使用动物园进行实验的范例
1、 Z4＋HVT二价活苗的实验室免疫效力试验；
2、 Z4保护力及其致瘤性测定；
3、 应用粘附素单抗治疗仔猪下痢的研究；
4、 免疫血清的制备；
5、 病毒常规毒力指标测定（包括使用鸡鸭鹅胚）；
6、 细菌毒力测定等。
第十三章 电泳技术、层析技术
有关电泳技术、层析技术已分别在前面各章节中讨论，这里不再单独赘述。对于刚开始实验工作的人员请详细参阅：
1、 Mononlonal Antibodies：Principle and Practice James W。Goding
2、 生化实验技术与原理
隋德新
单克隆抗体：原理、方法及应用
刘秀梵
第四部分 家畜传染病学实验指导
目录
家蓄传染病学实验规则
附 学生实验守则
家蓄传染病实验报告内容
实验一 碳疽的诊断
实验二 巴氏杆菌病的诊断
实验三 结核杆菌病和布氏杆菌病的检疫
实验四 猪瘟的诊断
实验五 鸡新城疫的诊断
Ⅰ、鸡新城疫病毒的鸡胚分离
Ⅱ、免疫荧光实验
Ⅲ、HA和HI试验
实验六 鸡马立克氏病的琼扩诊断
实验七 沙门氏菌快速检验试验
实验八 鸡白痢的检疫
家蓄传染病学实验规则
1、 实验前必须穿好工作服，实验后必须认真洗手后方可离开实验室。
2、 实验室禁止饮食、吸烟，勿以手指、器械等与面部接触，以防感染 。
3、 操作时务须聚精会神，严肃认真，不得顾盼言他。
4、 污染的器皿及废弃病料、污水等均应严格按规定处理。
5、 菌种、毒种不得擅自带出实验室。
6、 爱惜实验器械，若有损坏应主动登记、报告。
7、 保持实验室安静、整洁。
8、 实验后，必须关好水电，清洗整理好本小组物品。
9、 每次实验完毕，值日生应认真预习，熟悉实验内容，实验完毕应以科学态度写出实验报告。
附一 学生实验手则
1、 实验前应认真预习，经教师质疑不合格者不得进行实验。
2、 服从教师指导，按规定和步骤进行实验，认真地观察和分析实验对象，如实地记录实验数据，不得抄袭他人实验结果。
3、 要注意安全，爱护实验用具和设备，节约水、电、气和实验材料等。
4、 进入实验室或实验场地，必须衣着整齐，保持安静，严禁谈笑喧哗、抽烟、随地吐痰，更不得动用与本实验无关的其他仪器设备或教学标本等。
5、 认真作好实验报告，凡不合格要求者，均须重做。
6、 实验完成后，主动整理好实验用具，关好水、电、气流，搞好清洁卫生。
7、 凡违反实验规程或擅自动用其它实验用具、设备而导致损失者，必须写出书面检查，并按要求赔偿损失，情节严重者给予纪律处分。
家蓄传染病实验报告内容
1、 送检病例情况简述。
2、 诊断程序和结果。
3、 诊断意见。
4、 分析和讨论实验结果。
5、 实验诊断注意事项。
实验一 炭疽的诊断
一、 目的
掌握炭疽的实验室诊断步骤和方法；
学习和复习实验室的基本操作方法；
二、 实验器材
试管架铁丝篓酒精灯酒精棉球碘酒棉球剪刀镊子解剖台纱布搪瓷盆解剖刀铂金耳消毒试管载玻片擦镜纸镜油染色缸吸水纸滴管平皿离心机天平玻璃铅笔
10％甲醛溶液美兰染色液瑞氏染色液革兰氏染色液普通琼脂平板血琼脂平板肉汤培养基毛细滴管滴头炭沉管纸盒炭疽沉淀血清1％新洁尔灭消毒液0。2％升汞消毒液新鲜移植菌种斜面纯培养小白鼠
三、 实验动物的准备
实验前一周着手准备，在严格隔离条件下进行，将炭疽杆菌菌种移植到一支肉汤培养基中，37℃培养12…18小时，用此幼龄培养物，小白鼠皮下或腹腔注射0。1…0。 2ml/只，小白鼠在注射后2…3天死亡，死鼠冷藏供实验用。
实验前一天，分别移植炭疽杆菌和枯草杆菌到血斜面上进行培养，供实验时做对照用。
四、 实验步骤
1、 无菌操作解剖小白鼠，从小白鼠脾脏或肝脏作细菌分离培养于普通平板、血平板和肉汤培养基中。
2、 取脾、肝或血液在载玻片上作触片或涂片。
3、 用炭疽杆菌纯培养物和枯草杆菌纯培养物在另一块载玻片上作涂片。
4、 待步骤2、3中的触片和涂片自然干燥，火焰固定，在5…10％甲醛溶液中浸泡10…15分钟，灭活细菌，置玻片架上晾干。
5、 组织触片用美兰染色，纯培养物用革兰氏染色，镜检，观察细菌形态。
6、 Ascolis反应
取脾脏、肝脏数克剪成小块，置消毒试管中，加3…5倍量生理盐水，隔水煮沸30分钟，2000转/分离心15分钟，吸取脂肪层下的溶液与炭疽沉淀血清作Ascolis反应。
示教实验 串珠试管
五、 思考题
1、 炭疽杆菌的形态特征和培养特征主要有哪些？与枯草杆菌有什么区别？
2、 Ascolis反应的原理是什么？它在炭疽诊断中是否可靠？为什么？
3、 炭疽杆菌在什么情况下能形成串珠现象？
4、 肉联厂发生了疑似炭疽，应如何尽快进行诊断和处理？
实验二 巴氏杆菌病的诊断
一、 目的
观察鸡巴氏杆菌病的临床表现和病理变化；
掌握巴氏杆菌病的实验室诊断方法。
二、 实验器材
美兰染色液 瑞氏染色液
载玻片 染色缸 吸水纸 显微镜 镜油 擦镜纸
试管架 铂金耳 酒精灯 镊子 剪刀 生理盐水
肉汤培养基 血平板 酒精棉球 0。1％新洁尔灭消毒液
送检鸡
三、 实验动物的准备
１、 移植鸡巴氏杆菌强毒株于一支血斜面和一支肉汤培养基上，３７℃培养２４小时。
２、 用生理盐水洗下血斜面上的巴氏杆菌菌落，制成菌悬液，取２０ｍｌ注射于小白鼠腹腔，小白鼠在２４－４８小时内死亡。
３、 无菌操作解剖死鼠，去死鼠肝脏触片，染色，镜检，若确为巴氏杆菌致死，则取出肝脾于玻璃磨碎器中，加入５－１０倍量的肉汤培养基或生理盐水，磨碎，制成组织悬液，取该悬液0。3…0。4ml注射健康鸡；肌注，通常鸡在注射后24小时死亡，死鸡供实验用。
四、 实验步骤
１、 解剖鸡。无菌操作，自肝脏作细菌分离于血琼脂平板，37℃培养16…24小时，观察培养结果。
２、 取肝、心血制触片或涂片数张，美兰和瑞氏染色，镜检，观察细菌形态。
３、 仔细观察死亡鸡病变（肌肉、皮下、肝、心包、心冠脂肪、肺、浆膜、粘膜等脏器组织病变），并做记录。
４、 示教组织中的巴氏杆菌。
五、 思考题
１、 巴氏杆菌的菌落和培养特性是什么？
２、 为什么巴氏杆菌成两极染色？
３、 什么是巴氏杆菌的荧光现象？与致病菌性有无关系？
４、 巴氏杆菌能致多种动物的疾病；其主要特点是什麽？
５、 从病猪脏器分离到巴氏杆菌；；是否就可以确诊为巴士杆菌病？为什么？
６、 研制巴士杆菌疫苗要注意什么问题？
实验三 结核杆菌病和布氏杆菌病的检疫
一， 目的
掌握结核杆菌病的变态反应诊断方法；
掌握布氏杆菌病的血清学诊断方法。。
二；实验器材
消毒盒 剪毛剪 镊子 游标卡尺 纱布 变态反应用金属注射器和针头 结核菌素 记录表 酒精棉球 搪瓷盘 兽用16号针头贴有标签的无菌5ml试管 胶鞋
试管架 干净试管 干净吸管（1ml或5ml）100ml三角烧瓶 0。05％石炭酸生理盐水 布氏杆菌阳性诊断血清 布氏杆菌试管凝集试验用抗原 被检牛血清 振荡器 布氏杆菌阴性诊断血清
三；实验步骤
（一） 第一次实验（地址：牛场）
内容：变态反应皮内试验和采血
1；将牛固定好。
2；在成牛颈侧中部上1/3处剪毛；直径为10cm
3；用游标卡尺测量术部中央皮皱厚度并作好记录
4；术部用酒精棉球消毒
5；向术部中央注射0。2ml结核菌素；注射时应同时向前和向皮肤内用力；将针头斜向刺进皮内；并应立即用左手固定针头；或手慢慢将结核菌素注射进皮内。抽出针头后；用手指检查注射部位是否有突起的硬块；若无硬块必须重新注射。
6；寻找颈静脉。
7；在颈静脉处剪毛，术部用酒精棉球消毒。
8；左手按住颈静脉的术部向心端；右手将16号针头垂直或沿颈静脉走向斜向刺入颈静脉；调整针头插入深度使静脉血从针头流出；立即用消毒试管收集流出的血液，在采血的过程中，左手始终要按紧颈静脉的术部向心端；扎针时要看清突起的血管，果断用力，力求一针见血。
9；每头牛采3…5ml血液，送开左手后；右手拔出针头；用酒精棉球消毒术部，在收集血液的试管上标记上相应的牛号。将采有血液的试管斜放，待凝固后，带回实验室分离血清，以便进行布氏杆菌凝集实验。
结核菌素点眼试验（操作示范）
（1） 保定牛。
（2） 仔细检查牛眼睛，发炎者不能做点眼试验。
（3） 用左手拇指和食指将牛眼的上、下眼睑分别向上、下翻张使眼结膜囊暴露，右手用1％硼酸棉球擦去眼周围活物。
（4） 右手用滴管将结核菌素…5滴滴入眼结膜内，滴管头不要接触眼结膜。
（二） 第二次实验（地址：牛场）
1 ，变态反应皮内实验。必须在第一次注射结核菌素后，分别在７２小时和第１２０小时观察注射局部的反应情况。主要是观察有无炎症反应；并测量皮皱厚度和肿胀面积的大小，据此判定试验结果，对第72小时观察，反应呈阴性或可疑的牛只须立即在第一次注射的同一部位，以同一剂量进行第二次注射，剂量同第一次。第二次注射后48小时（即第一次注射后第120小时）应在观察一次。观察情况均有详细记录。
变态反应点眼实验 应于点眼后3；6；9小时各观察一次；并作好记录，必要时可观察第24小时的反应；观察时可作翻眼检查
（三）分离血清步骤
１、 将试管中凝固的的血清检样，2000转/分离心15分钟。
２、 将血凝块上的血清用滴管吸至另一空的消毒试管中，然后将原试管上的牛号标签贴至血清的试管上。
３、 如果离心后仍无血清析出，可用干净铁丝插入管底，沿管壁移动铁丝使血凝块与试管分离，再离心，并重得步骤2。
４、 血清置4℃冰箱保存，72小时内作布氏杆菌试管凝集试验。
（四）布氏杆菌试管凝集试验
１、 操作方法表解如下：
试管号 1 2 3 4 5 6 7
稀释倍数 1：25 1：50 1：100 1：200 1：400 阳性对照 阴性对照
试
液
0。5％石炭酸生理盐水 2。4
0。1
0。5 0。5
0。5 0。5
0。5 0。5
0。5 布氏杆菌阳性诊断血清（1：100）
0。5ml
弃0。5ml 布氏杆菌阴性诊断血清（1：100）。
0。5ml
布氏杆菌诊断Ag（1：20） 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5
充分振荡；混匀；37℃温箱24小时；观察结果
２、 比浊管制备
3。5％石炭酸生理盐水
布氏杆菌诊断Ag液（1：10）
清朗度
标�
