实验室手册-第3章

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6、 调节“温度”旋钮时勿用力过大，以防止移动紧固螺丝的位置，影响PH准确度。
第八节 各类冰箱的使用与保养
1、 根据物品的保存要求，选择适当　的冰箱贮藏。
2、 依据分类存放的原则，定箱定点放置物品。
3、 冰箱内存放的物品　要经常　整理，没有保存　价值的物品　及时废弃清理。
4、 冰箱要经常除霜，以保证正常、高效的运行。每天上下班，请留心冰箱工作状况，特别是低温冰箱。
5、 冰箱内严禁放置食品。
6、 高温季节注意冰箱的散热情况，减少开门次数和缩短开门时间。
7、 经常　擦拭冰箱，保持　冰箱清洁工。
8、 详细低温冷藏的注意到事项参见有关章节。
第九节 电泳装置
一、电泳系列操作注意事项
1、 进行各类电泳，如琼　脂糖电泳、PAGE、SDS—PAGE、IEF、WB等时，务必事先详细　设计好程序。
2、 根据不同类型的电泳要求，参见有关说明书设置电泳仪的各项控制钮。
3、 依据　分离物质的性质不同，选定合适的电泳种类、凝胶浓度及特殊用试剂。
4、 电泳过程中，仔细　观察工作情况，切勿电泳过头或分离不足。
5、 发现故障及时报告并排除。
6、 有关详细操作程序逻辑参见有关章节及专业书籍。
二、凝胶真空干燥操作步骤
1、 打开温度定时开关，预热加热板。
2、 放两层Whatmann3号滤纸（或新华3号滤纸）在多孔筛板上。
3、 将需要干燥的凝胶片放在一张浸湿的厚滤纸上，随后放到多孔筛板的干滤纸上。
4、 用一张薄的塑料膜鲜纸（或玻璃纸）复盖在凝胶表面。用手指小心抹干，以除去气泡
5、 将多孔筛板及凝胶放在干燥器的铝合金表面上放正。
6、 盖上硅橡胶板，接通真空泵，重调定时开关。
7、 待凝胶干好后，关掉真空　泵，揭开硅橡胶，取出凝胶（己固定在滤纸上）
附：透明胶片制作方法
　　　　　　　　下层：半透膜（可用透析袋代）
　　　　　　　　中层：凝胶片　　
　　　　　　　　上层：塑料膜鲜纸（或玻璃纸）
　　　　　　　注意事项：
1、 一般凝胶干燥可用法80度。但为了作放射自显影或荧光摄影时应用60度烘干。
2、 对于高胶连的聚丙烯酰胺凝胶；厚度较厚的凝胶或梯队度胶；要防止凝胶断裂；此时　应以60度烘干为好。
3、 一般凝胶在用较好的真空泵抽气时；干燥时间约为4060分钟；在凝胶未宗全干燥之前不能打开硅橡胶板；否则引起凝胶断裂。
4、 用于硝酸纤维膜的干燥；不能用加势档；仅用真空泵抽干即可；否则能引起事故。
第十节 空调机、抽湿机、微波炉
一、 抽湿机使用注意事项
9、 经常倾云积水槽内的水，当其内的水量达到1。85公斤时，抽湿机即自动停止工作。
滤尘网至少每两星期即要清洗一次；机身用干布或沾有洗涤剂的湿布来抹拭槽橱及机身，切不可用其它化学药品洗涤。



4、不要用化学药品如汽油、挥发性油洗涤该机，或用水冲洗之。
5、厉行节约，不需要开空调机就不要使用。人离开前，切记关机。
三、 RP…63OD微波炉使用注意事项
1、 微波炉内空载时，请勿使用。
2、 微波炉门未关前或门关闭不良，请勿打开开关。
3、 金属容器或物品切忌不要放入微波炉内，以防发生电火花损坏微波炉和容器。
4、 不要用纸、布、毛制品包物品放入微波炉，以免损坏或引起意外事故。
5、 微波炉使用后，可放入一杯水，以吸收余热。
6、 保持微波炉内外壁、门、托盘的清洁，但切记在操作后，马上用凉水冲洗，以防破裂；微波炉使用后，应抹干内壁的水汽。
7、 微波炉有故障时，切勿使用，应送专职人员检修。
8、 功能选择：
Power　　level　Percentage/Output
High　　　100％/650w
M。High　　　　　70％/450w
Medium　　　50％/320w
Defrost　　　30％/200w
Low　　　　15％/90w
第十节 KZBZ…40自动颗粒制冰机
1、 该机由电子部分、制冰部分和颗粒冰推进部分组成，按程序工作。每小时可制冰5公斤，蓄冰量可达20公斤，24小时连续制冰，
2、 本机为水冷散热型机组，要求通风良好，离墙和其他物之间距离应大于30厘米。
3、 开机前切记检查水源是否接通，机器背面左下侧的进口用橡胶管套紧并接自来水，接好扎牢后方可打开水源（注意：进水压应在1。4…4。0kg/cm2）。
4、 开启水源后，吸需打开正面的电源开关，机器就会按程序工作。若水源停止供水时，应关闭机器。
5、 在制冰过程中应关闭蓄冰室门，整机在开机15分钟后方可出冰；1小时后取冰，这时的冰温度最低（…8），硬度最强。
6、 机器背面右侧面有个放水口，接上一根30cm长的橡胶管引致一只存水盆收集制冷过程中的水滴和融化的冰水。
7、 当蓄冰室冰满后通过电子控制自动停机，当驱除部分冰后，机器又自动工作制冰。
8、 整机应保持干净，机器上面不应放杂物，严禁通电时搬动。
9、 关机后，应关闭水源。当较长时间不使用时，应清理蓄冰室等部件。
第十一节 其它仪器设备
一、 LRH…150B型生化培养箱使用说明书和注意事项
1、 电源开关拨至“开”位置，电源指示灯亮，机器开始工作。
2、 温度调整：
（1） 将温度显示开关拨至“开”，数显表电源接通。
（2） 将“整定”、“测量”共用开关拨至“整定”位置，然后旋转温度刻度盘，直到数显表显示出所需要的温度值为止。
3、 将共用开关拨至“测量”档，
此时数显表显示温度仅仅是箱内实际温度，但此时的温度将随机器的工作状态而改变，当机器达到平衡状态，即既不加热，也不制冷时，则数显表所显示数值即为所需温度值。
电源接通后，调节好所需的温度，这时不能随便将控温旋钮来回多次旋转，以免压缩机启动频繁，造成压缩机出现过载现象，影响压缩机寿命。
4、若开机后，经过一段时间，加热、制冷指示灯均不亮，则表示箱内温度达到
平衡，等于所需温度…补偿，故加热指示灯出现闪烁现象是正常情况，但要防止两灯同时亮，否则表明机器出现故障，须即使检查、理。
4、 当使用温度较低时，应定期倒掉位箱内底部接水盘内的积水。
5、 箱内无需照明时，应将面板车上的照明开关置于“关”位置。
6、 严禁用手或其它硬件碰撞、拉动箱内的控温探头，以免造成失控制。
7、 若机器运转出现故障如控温失灵，不加热或不制冷，须先切断电源，分别检查保险丝是否完好，再检查相应部分。
二、 YXQ。G01。280手提式高压蒸汽消毒使用说明
1、 首次使用必须了解消毒器内物品如何包扎——堆放——（加水）——密封——加热——　消毒——干燥——冷却的方法，最好是在有关
人员指导下进行操作。
2 、始终应保持消毒器内有足够的水量（约2。5公斤）
3 、在消毒开始时一定要将汽阀开放，使消毒桶内的空气逸去，否则　会得不到良好的消毒效果。
4 、溶液应灌装在硬质耐热的玻璃容器内，不要灌装得太满，一般灌至容器的1/2~3/4容积。
5 、不允许将不同类型不同消毒要求的物品放在一起消毒。
6 、每周将安全阀开放数次，这样可以保证安全阀处于良好的灵活状态。
7 、压力表使用日久后会使读不准确，应检修或换上新表。
8 、平时注意消毒器的清洁干燥，可以延长使用年限。
9 、消毒过程中操作者最好不要离开现场，若要离开，一定要交待他人代为看管。
10 、不同物品消毒所需时间、温度与压力：
消毒物类　　　　　　消毒所需保温　　　　　　　蒸汽压力　　　　　　　表　压　　　　　饱和蒸汽相　
　　　　　　　　　　　　　　时间（分钟）　　　　　　（公斤/厘米）（碳/英寸）　　　对温度（　）　　　
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橡胶类　　　　　　　　15　　　　　　　　　　　　　　　　1。05　？1。1　　　　　　　　15？16　　　　　　　　　121　　　　
敷料类　　　　　　30？45　　　　　　　　　　　　　　　1。05？1。4　　　　　　　　　15？20　　　　　　　121？126　　　　　
器皿类　　　　　　　　15　　　　　　　　　　　　　　　1。05？1。4　　　　　　　　　　15？20　　　　　　　121？126
器械类　　　　　　　　10　　　　　　　　　　　　　　　1。05？1。4　　　　　　　　　　15？20　　　　　　　121？126　　
瓶装溶液类　　20？40　　　　　　　　　　　　　　　1。00？1。4　　　　　　　　　　15？20　　　　　　121？126　　
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三、 其实各类仪器使用前请详细阅读使用说明书，这里不在一一介绍。




　　　　　　　　　　　　　　　　第三部分　　实验室常规试验程序
第一章　组织培养及常用溶液的配制
第一节 鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞（DEF）培养
一、 材料
9？10日龄鸡胚　　13？14日龄鸭胚　　　眼科剪、　镊、外科镊　、巴氏吸管　、蛋架、灭菌平皿　　　25ml小三角瓶　　Hanks＇液　　0。25％胰酶液　　Versene液　　灭菌纱布、玻璃漏斗、0。1％　结晶柠檬酸（0。1M）或0。4％台盼兰；血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。　　　　　　　　
二　方法（CEF为例）
鸡胚　理：取9？10日龄鸡胚直　　于蛋架，在气室部用于5％碘酊棉　消毒，再用洒精棉　脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1…2mm的碎块，加Hank’s液20ml；略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。
2、 消化：将0。25％胰蛋白酶溶液用5、6％NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。必须注意每次吹吸一般6—7次为宜　，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。
在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。
二、 细胞计数：
取细胞悬液0。1（100ul）置盛有0。9ml10。4％台盼蓝的试管中混合；用血球计数板计数。
计算方法：　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4大方格细胞数
每ml细胞数=——————————————X10（5）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4
　　　　　　　　　　　　　　　5中格细胞数
或每ml细胞数=——————————X10（4）
三：接种
以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm　　dish（10ml），60mm　　dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。
四、CEF单层可供作病毒TCID50LD50等指数的测定；空斑计数病毒中和试验等。

第二节　溶液配方
一、PBS

1、无钙镁PBS
　　　　　　　　　　　　　　　　　　50X　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Less　NaCl）
1000ml　　　　　　　　　　　　　　　　双蒸水
10g　　　　　　　　　　　　　　　　　　　KCl
　　60g　　　　　　　　　　　　　　　　KH2PO4
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　60g　　　　　　　　　　　　　　　　Na2HPO4（Na2PO4。12H2O　151g）
溶后分装20ml管，…20　保存
20ml　　　　PBS　　　　　base　　　50X
8g　　　　　　NaCl
0。3ml　　　　0。5％酚红
980ml　　　　双蒸水　　　　　　　　　　　　　　15P　　　　11分钟
2、NaCl　　　　　　　8。0g
　　　KCl　　　　　　　　0。2g
　　　CaCl2　　　　　　0。1g
　　　MgCl2　　　　　　0。1g
　　　Na2HPO4　　　1。15g（Na2HPO4。12H2O　；　　　2。92g）
　　　KH2PO4　　　　　0。2g
双蒸水至100ml；　过滤除菌，50保存。
3、 分别配制A、B、C原液
A液：　NaCl　　　　　　　　　80。0g
　　　　　　　KCl　　　　　　　　　　2。0g
　　　　　　　KH2PO4　　　　　　2。0g
　　　　　　　Na2HPO4。2H2O　　　　　　14。4g（Na2HPO4。12H2O　　　29。0g）
　双蒸水至800ml
B液：CaCL2　　　　　　0。5g
　　　　　　双蒸水　　　　　500ml
C液：MgCl2　　　　　　0。5g
　　　　　　双蒸水　　　　　500ml　
以上三液分别　10P10’高压蒸气灭菌，冷却后
A　　　　　　　　　　　　　　　　　　　80V
B　　　　　　　　　　　　　　　　　　　100V
C　　　　　　　　　　　　　　　　　　　100V
H2O　　　　　　　　　　　　　　　　720V
无菌混合
注意：
　　　各化学药品的结晶水重量是否扣除！
二Hank’s　　Solution
　　　分别配制　A、B原液
A液：NaCL　　　　　　　　160。0
　　　　　　KCl　　8。0　　　加入800ml双蒸水　　　　　
MgSO4。7H2O
MgCl2。6H2O　　　2。0
　　　　　　CaCl2　　　　　　　2。8（溶于10ml双蒸水）
双蒸水加至　1000ml　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
B液：Na2HPO4。12H2O　　　　　　3。04g
　　　　　　KH2PO4。2H2O　　　　　　　　1。2g　　　　　　800ml双蒸水
　　　　　　Glucose　　　　　　　　　　　　　　　20。0g
0。4％酚红液100ml
双蒸水至1000ml，2ml氯仿防腐，4保存。
A　　　　1V　　　10P　　　10min　　　灭菌
B　　1V　　10P　　10min　　灭菌
双蒸水　　18V　　10P　　10min　　灭菌
1…4保存，可用１个月。
用5。6％NaHCO3（10P　　10min　　灭菌）或3。5％，调PH至7。2—7。6（加NaHCO3后须立即使用）。
三、0。4％酚红液。　　　　　　　　　
　称酚红0。4g→置乳钵滴加0。1N　　NaOH（总量11。2g/ml）并不断研磨→所有颗粒全部溶解→100ml量瓶，将已溶后的吸入，用双蒸水洗钵数次，倒入→加双蒸水至100ml摇匀，4℃保存。

四、 Versene液
乙二胺四乙酸二钠（Versene）　　0。2克
NaCL　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　8。0克
KCL　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0。2克
NaH2PO4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1。15克（NaH2PO412H2O=2。9）
KH2PO4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0。2克
双蒸水至1000ml；10P’；10’灭菌；4℃保存；可用3个月。
五、 胰酶液Tryptase
一般配成0。25％
取0。25克溶于100mlHank’s滤过除菌；分装小瓶。…20℃保存。用前融化加入青链霉素100单位/ml并用5。6％NaHCO3滴定至PH7。4…7。6
注意：
1． 为避免消化细胞成团，可配无钙胰酶液．
2． 胰酶威无臭无味的白色粉末，应密封保存，阴暗处防潮解，可分装小瓶保存．
3． 胰酶液的浓度随其活力和消化细胞的来源和种类而定．一般消化配组织用0。1％。
六。碳酸氢钠液
取NaHCO35。6克溶于100ml双蒸水中；使完全溶解后；经滤纸过滤后；分装于瓶中（5ml或2ml）10P；10’灭菌。塞紧胶塞；贴上标签；注明批号日期；4度保存备用。（在4度应为透明液；不得有沉淀）。每瓶开启后使用不得超过2次。
七。0。5％乳蛋白水解叶（LAH）
取5克乳蛋白水解物溶于100mlHank’s液中；根据需要分装50…100ml瓶；立即10P；20’灭菌；4度保存备用；用前；用5。6％　NaHCO3滴定PH7。4…7。5。
注：乳蛋白水解物极易潮解；平时必须将瓶塞紧；最好储存于干燥器中；乳蛋白水解物含有丰富的营养成分。0。5％乳蛋白水解物溶液加入适量抗生素和血清；即可用于一般的细胞培养。
（一）。CEF培养
0。5％LAH
CS　　　　　　　　　　5％
Pen　　　　　　　　　　100unit
Str　　　　　　　　　　　100ug/ml
5。6％　NaHCO3调PH至7。2…7。4
（二）PK细胞培养
0。5％LAH　　　　　　　89。5％
CS　　　　　　　　　　　　　10％
Pen/Str　　　　　　　　　100unit/100ug/ml