实验室手册-第4章
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（二）PK细胞培养
0。5％LAH 89。5％
CS 10％
Pen/Str 100unit/100ug/ml
八。Earle’s液
甲液：NaCL 68g
KCL 4g
NaH2PO4 1。4g
葡萄糖 10g
双蒸水至500ml；溶解后加氯仿1ml防腐
乙液：CaCL2 2。0g
MgCL2 1。7g
0。4％酚红50ml
双蒸水加至500ml；0…4度保存备用；按比例配成Earle’s液。
甲 1V 10P 10’灭菌
乙 1V 10P 10’灭菌
双蒸水 10V 10P 10’灭菌
4度保存备用；用前用5。6％ NaHCO3调PH至7。4…7。5
九。抗菌素溶液（Pen/Str）
用灭菌双蒸水配制每毫升含
Pen（青霉素）10；000units
Str（链霉素）10；000ug
分装小瓶；…20度保存。一般培养液加这种Pen/Str％；最终浓度为100unit/ml。
十、199—F10生长液
199 5。49g（4。95g）
F10 4。9g
NaHCO3 1。7g
S。P 1ml（10万U/ml）
BFS 40ml
DDW 至1000 ml
过滤后分装备用。
199…F10维持液：BFS仅用10ml；余者同上
第三节 配制溶液的注意事项
1使用化学药品为A。R。级；标签清楚；最好组织培养专用；防止使用和保存过程中的混淆和污染。
2。配制溶液的用具；需经严格洗刷和消毒；其配制过程尽量在无菌操作下进行。
3。称量药品应力求精确。配制溶液应有详细记录以及消毒，保存；分装和使用情况。
4。配制的每批溶液；需经试用后；方可大量使用。因此需提前配制溶液。溶液保存有一定期限；保存时应经常检查；发现可疑现象和过期；不得使用。
5。注意节约；计划用多少就配多少。
第二章 淋巴细胞杂交瘤技术及使用溶液的配制
第一节 融合程序
融合方法：
1、 将108 脾细胞与2—5x107 SP2/0细胞混合于1支50ml融合管中，加入30mlDMEM基础液；
2、 1000r/m离心5分钟；
3、 吸净全部培养液；
4、 在手掌上轻击离心管底部以打碎细胞积块，置400C水浴中预热；
5、 用1ml吸管在45秒内加预热至370C的50％PEG（PH8。0）1ml，边加边搅；
6、 用1ml吸管在90秒内加20—30ml
7、20—37℃静置10分钟；
7、 1000r/m5分钟；
8、 弃尽上清，轻击离心管底以分散细胞积块，重新悬浮于80—100mlHAT培养基中；
9、 按比例加入107 —2X77 腹腔细胞（约2只小鼠）；
10、 分装96孔细胞培养板，每孔0。10__0。15ml；24孔板，每孔1。0__1。5ml；
11、 7。5％CO2；37℃孵箱里培养；
12、 5天后HAT培养基换出1/2培养液；
13、 7__10天后用HT培养基换出HAT；
14、 经常观察杂交瘤细胞生长情况；待长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
15、 其它详细资料请参阅刘秀梵教授编。
第二节 溶液配方
一、 基础培养液：
1、老配方 DMEM 13。37g＋1000ml双蒸水使之溶解
丙铜酸钠 0。11g
碳酸氢钠 3。6g
pen/str 20万/2
0． 22u过滤，分装，4℃保存（不超过1个月）
2、新配方 DMEM基础液：
四蒸水 980ml NaHCO3 3。7g
DME（Giboo） 13。37g S。P（100X）10ml（本实验室用1支庆大霉素）
1NHCl调试PH至7。2_7。4（本实验室用1NnaOH调至7。2_7。4）；过滤除菌；分装后4℃保存。
3、 DMEM完全培养基：
30mlDMEM基础液中加15…20ml BFS，1mlL…G（100X）即为完全培养基。
4、 HT培养基
100mlDMEM完全培养基中加入100X HT 1ml即成，或按下列配方直接配制：
四蒸水 980ml
DME（Giboo） 13。37g L。G（100X） 10ml
HT（100X） 10ml BFS（NCS） 150_200ml
NaHCO3 3。7g S。P（100X） 100ml
用1NHCl调至7。2_7。4； 过滤除菌；分装后4℃保存。
二、 100Xaminopterin（4x10（…5）M MW=440。4）
1。76mg A＋90ml双蒸水＋0。5ml 1N NaOH助溶，双蒸水加至100ml＋0。5ml 1N HCl中和；0。22um滤膜过滤除菌；分装2ml小瓶；…20℃保存。
三、 100XHT
Hypoxanthine：MW 136 10（…5）M solution
Thymidine： MW242。2 1。6X10（…1）M solution
H和T可以配在一起，136。1mgH＋100ml双蒸水＋1N NaOH至H溶解；加T38。8mg；把PH用醋酸调至9。5； 0。22um滤膜过滤除菌；…20℃保存。
四、 100Xglutamine 200Mm Solution
2．92g glutamine
100mlDMEM基础液，；37℃助溶液
0。22um滤膜过滤除菌；分装2…5ml小瓶，…20℃保存。
五、融合剂配制：PEG（Baker 1000）20…50g于三角瓶中，盖紧，60…80℃水浴融化，0。6ml分装于青链霉素小瓶中，高压蒸汽灭菌，…20℃保存备用。临用前加热融化，加等量DMEM基础液，用少许5。6％NaHCO3调PH至8。0。
第三节 单抗制备技术中的其它方法
一、杂交瘤细胞的克隆化
1、 制备小鼠腹腔细胞；
2、 制备待克隆的杂交瘤细胞悬液；用不着5…20％血清的HT培养基稀释后使每毫升含2。5、15、50个细胞3种不同的稀释度。
3、 按每毫升加入5X10（4）…5X10（5）个细胞的比划，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔细胞；
4、 每种杂交瘤细胞分装货6孔板一块，每个稀释度32孔，每孔的量为0。2ml，每孔的杂交瘤细胞分别为0。5、3、10。（或将士、3、4步改为配制15毫升HT培养基中含100个细胞，加入腹腔细胞后分装96孔1块）；
5、 37℃，7。5％CO2湿润培养基7—10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；
6、 在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；
7、 取阳性的细胞扩大培养，并冻存。
二、 细胞冻存和复苏方法
1、 将对数生长期的杂交瘤细胞或其它细胞 离心，重新悬浮于预冷的冻存液中（其中含10—20％小牛血清，10％DMOS的HT培养基），浓度至少5X10（6）/ml。
2、 分装安瓶，每瓶1ml，置水浴上。
3、 封口后，将发瓶入入一带收口绳的小布袋内，立即将布袋放入内衬石棉的百铁筒内，置—70℃冰箱。
4、 2—4小时后，或过夜后，将布袋移入液氮罐。
注意：在—70℃保存时间不宜过长，一般不超过24小时。
5、 复苏细胞时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴中融化，待最后一点冰快要融化时，从冰浴中取出，置冰浴上，用5—10mlHT培养基稀释，离心后，再悬浮于适量培养基中，装瓶，置37℃含7。5％CO2培养箱中培养。
6、 如细胞存活率不高，可加腹腔细胞 进行培养。
7、 细胞 存取均应为高，可加腹腔细胞进行培养。
8、 细胞存取均应做好记录。
三、 单抗的大量生产
1、 腹腔接种降植烷（Pristane）或液体石腊，每只小鼠（2月龄以上）0。5ml。
2、7—10天后腹腔接种PBS稀释的杂交瘤细胞，每只鼠5X10（5）/ml0。2ml。
注意：每只鼠接种细胞 数不可太多或太少，否则单抗菌素产量不高。
3间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨起，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2—3次，通常每只小鼠可采5—10ml腹水。
5、 离心，去除细胞 成份和其它沉淀物，测定抗体效价，可加防腐剂（0。01％硫柳汞或者说％叠氮钠）小量分装；—70℃保存。
第三章组织培养使用物品的准备
1、 器材用后立即浸泡是很重要的事；
2、 分类洗涤、处理是必要的，不妨可分为不与细胞直接接触的器材和与细胞 直接触的器材，它的洗刷条例不尽一致；
3、 厉行节约，可以重复使用的器材不应废弃；
4、 需要特殊处理的器材，如病原材料污染的器材物品，须协助洗涤人员作无害化处理；
5、 高压消毒或高温干烤器械时，务必有人在场。
第二节 玻璃器皿的准备
1、 规格：组织培养用的玻璃器皿要求严格，以中性硬质玻璃为适宜，用于培养细胞 的培养瓶更应注意选择，一般常用的细胞 培养瓶有链霉素瓶，方形、园形克氏瓶等。蜕2瓶的接种面应平坦，瓶口内径力求光滑或正方形，防止瓶塞塞后漏气。其它培养中弯头吸管、试管、盛液瓶、平皿、吸管和注射器一般常用即可。
2、 洗涤
用过的玻璃器皿，先用清水冲洗，再以肥皂或中性洗衣粉水洗干净，浸泡于洗涤液中1—2日，取出后自来水冲洗7次，再用双蒸水或去离子水三盆，分盆冲洗5次，并在双蒸水或去离子水中浸泡过夜，晾干或烘干，包装消毒。新购置的玻璃器皿在25％的浓H2SO4或3％的稀盐酸中浸泡过夜，再进行以上洗涤、晾干、包装、消毒。
3、 包装、消毒
小培养瓶或链霉素瓶可放在普通铝制盒中，吸管在塞上棉塞后放在玻璃或金属筒中消毒。盐水瓶用牛皮纸包口后，160℃2小时，干热灭菌。
第三节 橡皮朔料制品的准备
1、 规格：
选用质软能耐高压，对细胞 毒性小的橡皮塑料制品。
2、 洗涤：
新的橡皮塞和橡皮管首先在1％NaOH中煮沸30分钟，然后用自来水冲洗5—7次，用双蒸水冲洗3次，再用双蒸水浸泡过夜色。用过的橡皮塞洗净后，以双蒸水煮沸30分钟，晾干，包装消毒。
3、 包装灭菌：
将洗涤、晾干的橡皮塞放在小铝盒内或培养皿内。其它橡皮制品用纸包好，15P20—30分钟。
第四节 其它用品的准备
一、 滤过用布：指麻布或娟布，剪成小块，浸于丙酮中，在室温经48小时，取出洗涤，以双蒸水洗3次，干燥灭菌备用。
三、 解剖用具：外科剪、镊等，可用干燥灭菌，160℃2小时或于使用前煮沸消毒
5—10分钟，每次用完后洗涤擦干。
附1 洗液配方
配方1 重铬酸钾 150g
蒸馏水 300ml
浓硫酸 30000Ml
将重铬酸钾沸水溶解，然后慢慢加入浓H2SO4，边加边搅拌，见发热过剧则稍停，冷却后继续加，此为强洗液。
配方2 浓硫酸 50％
蒸馏水 50％
重铬酸钾 5％
此为中等强度洗涤液
配方3 重铬酸钾 100g
蒸馏水 1000ml
加热溶解，冷却后缓慢加入工业硫酸100ml，此液为弱洗液，为棕红色，使用此液时，必须预热先用肥皂水将玻璃器皿洗净，经自来水冲洗沥干，然后才能浸入，否则该洗液很快失效。
盛洗涤液的容器要坚固，操作时要穿橡围裙，长筒胶靴，戴上眼镜和厚橡胶手套，以保安全。
洗涤一旦变绿，表示铬酸已经还原，失去了氧化能力，不宜再用。如将这样的洗液加热，再加适量重铬酸钾，可重新使用。
附2、玻璃器皿的硅化处理可以防止细胞粘附或提纯物质损耗在离心管可吸管上。下述的是溶硅的操作条例。
1、 工作液由1份硅胶加100份水制成。如要硅化大约24个15ml的离心管和200个用后便丢弃的巴氏吸管时，可准备600—800ml的工作液。
2、 在硅化前所有玻璃器材必须清洁和干燥，将溶液倒入离心管，放置至少5分钟。倾出，水冲洗2—3次。将巴氏吸管放满一个大烧杯，将硅胶倾倒在它的上面，直至所有吸管都有充满为止。放置至少5秒钟，将溶液倾出，用水彻底冲洗吸管。工作液不可再用。
3、 室温中气干器皿24小时，放入玻璃器皿干燥箱内，时间可较短。
第五节 纯水制备程序
1、 细胞培养用水必须使用三蒸馏或四蒸馏水，而大多数去离子水和常规一次蒸馏水一样不适于作为与细胞接触之用。
2、 四蒸水的制备，通常用去离子水，在双重石英蒸馏器中蒸馏2次，以达到纯净的目的。
3、 去离子水通常用一次蒸馏水，经离子交换树脂处理，并检查水质情况：水质清亮，一般电阻大约10万欧姆/cm，最高可达100万欧姆/cm；5％AgNO3检不出氯离子，PH8—10。
4、 离子交换柱必须安装在环境温度最高不超过40℃，最低不能低于0℃地方。
5、 新树脂预处理方法：
（1） 工业性生产的离子交换树脂出厂时难免有一些杂质，在使用前应先用清水冲洗，洗至水质清亮。
（2） 用4％HCL、4％NaOH（浓度不能超过6％）交替处理，在酸碱之间大量水洗，如此反复处理三次，即：酸一水，碱一水，反复进行，每次酸碱用量为树脂体积的2倍。在交换柱中动态进行，如在容器中处理应采取少量多次。
（3） 最后一次，阳性树脂应用酸处理使其成为H 型，所用酸量应加倍，水洗手去离子水。阴性树脂应用碱处理使其成为OH型，所用碱量应加倍，水洗用去离子水。
6、 经常以4—5％HCL再生阳性离子柱，（001X7强酸树脂）用量为树脂体积的2—3倍。以
4—5％NaOH再生阴离子柱。（201X7强碱树脂）。
附：A实验室用纯水质量表
精制方法
精制水的电阻率（欧姆。厘米）
纯水的理论值
蒸馏水
玻璃容器一次蒸馏
玻璃容器三次蒸馏
石英容器三次蒸馏
石英容器23次蒸馏
复床式
混合床式
1。83X10（7）
1。0X10（6）
5。0X10（5）
1。0X10（6）
2。0X10（9）
1。6X10（7）
1。0X10（4）
1。8X10（7）
附B实验室分析用水标准
序号
项目
指标
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 外观
PH
蒸发残渣（mg/l）
灼烧残渣（mg/l）
氨及铵盐（NH4）（ng/l）
碳酸盐（CO2）（mg/l）
硫酸盐（SO4）（mg/l）
氯化物（CL）（mg/l）
硝酸盐（NO2）（mg/l）
硅（mg/l）
钙＋镁（mg/l）
重金属（mg/l）
导电率（Ω） 无色透明，无臭无味
5。4—6。6
