实验室手册-第5章

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注意：不要先将水浴　温度调至56（度）再灭能血清，这样时间无法计算。
10、 待血清冷却后，置于20（度）冰箱保存　备用。
第四章 酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序
第一节 间接ELISA试验
一用可溶性抗原的ELISA：
1、 纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；
2、 以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；
3、 置4（度）过夜或37（度）吸附3h；
4、 PBST洗三次；
5、 每孔200ulPBS/NCS　　4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；
6、 PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）
7、 每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。若杂交瘤筛　选，每孔加杂交瘤培养上清；
8、 37（度）孵育2h
9、 PBST洗5次，每次5min
10、 每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP标记的抗小鼠（IgG＋IgM）抗体；
11、 37（度）孵育2h
12、 PBST洗5次，每次数5分钟；
13、 每孔加OPD　或TMBS底物100ul
14、 37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；
15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤：光片）；
16结果判定：
（1）P/N≥2。1　　　　　　　　　为阳性
　　（2）　　　P≥N＋3SD　　　　　　　　为阳性
　　成功范例：NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测　亚类鉴定和鸡白痢检疫等。
二、用全菌抗原的ELISA法
（一） GA法
1、 新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌　浓度至1X10（6）个/ml。　　
注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；
2、 酶标板中加200ul/孔，5％戊二醛（GA）溶液（0。1M　　NaHCO4　95ml＋25％DNY戊二醛溶液5ml）；37（度）；2小时
3、 蒸馏水洗5次；
4、 加细菌悬浮液；50ul/孔；
5、 37（度）温箱内过液；干燥吸附（20—24h）
6、 加PBS/NCS　　220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；
7、 PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；
8、 以下步骤同一。
（二） MA法
1、 细菌悬液（1X10（6））50ul/孔；
2、 室温或37（度）干燥吸附；用甲醇（MA）固定；室温10分钟；
3、 加PBS/NCS封闭，37（度）3小时或4（度）过夜；
4、 PBST洗5次（于—20度或4度保存备用）；
5、 以下步骤同一
成功范例：H单抗检测等。
　三、用全细胞抗原的ELISA
1、 按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染的细胞　，进行细胞　计数，用PBS制成适当浓度悬液；
2、 加100ul/孔细胞悬殊浮液于酶标板内，使每孔含细胞5X10（）
3、 将板离心1000rpm10分钟，甩去上清，室温干燥（可保存在4℃或—20℃备用）；
4、 PBST冼3次，每次5分钟；
5、 每孔加100ul第一抗体或杂交瘤　上清，设立对照；
6、 37℃1—2小时；
7、 PBST洗3　次；
8、 每孔加入100ul酶标第二抗体，37℃1—2小时；
9、 PBST冼5次；
10、 每孔加入100ul底绶冲液，室温作用30分钟；
11、 判定结果。
　　　　　　　　　　成功范例：粘附素单抗，O抗原单抗检测等。
　　　　　　　　　　注意：若需要，可灭活细胞内源酶，以减少本底反应。其它方法参见本章第六节。
第二节 直接ELISA
1、可溶性抗原或全菌抗菌素原（用量以方阵试验确定）包被标板（50—100ul/孔）；
2、PBS/NCS封闭板（保存备用）；
3、 每孔加50—100ul酶标抗菌素体；设立阴性、阳性对照；
4、 37℃孵育2h
5、 PBST洗5次，每次5分钟；
6、 以下同间接ELISA；
　　成功范例：沙门氏菌检验、抗血清效价测定、酶标抗体效价测定　等。
第三节 夹心ELISA试验
1、 单一或混合单抗腹水或纯化的免疫血清用包被液稀释后25—100ug/ml；（有人使用蒸馏水直接稀释腹水作包被）。
2、 以50—100ul/孔量加入酶标板中；
3、 置4℃过夜吸附或37℃吸附3h
4、 PBST　洗3次；
5、 PBS/NCS封闭，200ul/孔，4℃过夜或37℃3h；
6、 PBST洗涤5次，每次1min；（可于—20℃保存备用）；
7、 每孔加50—100ul待检抗原，同时设立阴、阳性对照；
8、 37℃孵育2h；
9、 PBST洗5次，每次5min；
10、 每孔加50—100ul酶标单抗或酶标纯化抗体；
11、 37℃孵育2h；
12、 PBST洗5次，每次5分钟；
13、 37℃孵育2h
14、 PBST洗5次，每次5min；
15、以下步骤同前。
　　　　　　　　成功范例：鸡新城疫病毒，大肠杆菌，沙门氏菌检测。
第四节 竞争ELISA试验
1可溶性抗原以包被液稀释至1ug/ml（需方阵滴定确定），（全菌抗原包被方法参见前述）；
2、50—100ul/孔，包被酶标扳；
3、4℃过夜吸附；
4、PBST洗3次。每次5分钟；
5、PBS/NCS封闭200ul/孔，37℃3hr或4℃（保存备用）；
6、PBST洗3次，每次5分钟（可—20℃或4℃保存备用）；
7、 加50—100ul/孔待检血清样品，再加入50—100ul/孔单抗，设立对照；
8、 37℃孵育1—2h；
9、 PBST洗5次，每次5分钟；
10、 每孔加OPD50—100ul；
11、 37℃避光作用10—20min；
12、 以100ul/孔加2M　H2SO4终止反应，测定OD490；
13、 判定结果：
（1） 抑制率（N—P/N）》50％判为阳性；
（2） OD490值《NCX　　Ⅹ0。3＋PCX　　　X　　　　　0。7为阳性（PCX为阳性对照的平均值；NCX为阴性对照的平均值）。
成功范例：检测伤寒、鸡白痢抗体等。

第五节 Dot—ELISA
1、 根据实验要求不同，选用硝酸纤维膜，混合膜或醋酸膜，并切成条带，以硬模压痕迹；
2、 以蒸馏水或TBS浸泡膜条带，取出晾干后备用；
3、 抗原包被：
（1）、可溶性抗原（ug/ul），每点点加5ul，37℃烘干；
（2）、全菌抗原（1X10（6）/ml），每点点加5ul；37℃烘干，可先将条带经5％GA处理后，37℃3h或4℃过夜，再加样烘干。
4、 TBS/NCS或BSA封闭；
5、 漂洗；
6、 将膜转入酶标抗体内，37℃0。5…2h；（间接法步骤是：先于第一抗体中浸染漂洗后，转入酶标第二抗体中反应）。
7、 漂洗；
8、 把膜置入DAB或4—氯—1—萘酚底物中显色，室温10—30分钟；
9、 漂洗；
10、 晾干后，判读结果（可以进行扫描分析）。
成功范例：脂多糖抗原检测，大肠杆菌检测　，单克隆抗菌素体筛选等。
第六节 酶标组化法
1、 抗原准备：
（1） 细胞涂片：
（2） 病变组织触片或冰冻切片；
（3） 生长细胞的培养孔或玻片；
2、 4℃丙酮固定10分钟；
3、 灭活内源酶：
将待检玻片浸入内源酶灭活液内，或于培养孔内加入内源酶　灭活液，室温灭活30分钟，弃去灭活液，以PBS和去离子水充分洗涤10—20分钟，自然干燥；
4、 以PBS/NCS封闭，37℃2小时或4℃过夜；
5、 酶染：加酶标抗体反应（或间接法步骤进行）37℃1—2小时，并设立对照；
6、 PBS洗15分钟表；
7、 以DAB显色，室温避光30分钟；
8、 镜检：细胞浆呈棕黄色，细胞　核无色，阴性对照无色，判为阳性。（4—氯—1—萘酚　显色）。
成功范例：猪瘟组化法诊断。
第七节 ELISA常用溶液的配方
一、 包被液
1、 碳酸盐绶冲液
0。2M　　Na2CO3：　12g无水Na2CO3＋100ml去离子水
0。2M　　　NaHCO3：1。68g　　NaHCO3＋100ml去离子水
取0。2M　　NaCO3：8ml，0。2M　　NaHCO3：17ml混合再加75ml去离子水；调PH至9。6。
2、 Tris—HCL绶冲液（PH6。0；0。02M）
0。1N　　　　　　Tris　　　　　　　　　100mｌ
0。1N　　　　　HCL　　　　　　　　　58。4ml
培养离子水加至1000ml
（Tris　　　　MW　　　　　　　　　121。14）
3、 其它包被方式，如（GA、MA、BSA等方法，请参阅有亲章节和文献。
　　　　　　　二、稀释和封闭液
1、 EPBA（PH7。2）
NaCL　　　　　80g　　　　　　　　　　　Na2HPO4。12H2O　　　　　　　14。5g
KCL　　　　　　　　2g　　　　　　　　　　　　KH2PO4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2g
去离子水10升
2、 EPBS/Tween—20/NCS：
EPBS＋0。05％Tween—20＋10％NCS　　or　　！％BSA
　　　　　　　　　　3、Tris—HCL绶冲液　　　　　　　　　PH7。0　　　　0。01M
　　　　　　　　　　　　　　　　　0。1M　　Tris　　　　　　50。0ml
　　　　　　　　　　　　　　　　　0。1N　HCL　　　　　　46。5ml
　　　　　　　　　　　　　　　　　　NaCL　　　　　　　　　　　　　8。5g
　　　　　　　　　　　　　　　　　　BSA　　　　　　　　　　　　　　　　50g
　　　　　　　　　　　　　　　　　　正常山羊血清150ml檬酸：
　　　　　　　　　　　　　　　　　　去离子水1000ml
　　　　　　三、洗涤液
1、 EPBS/Tween—20
EPBS＋0。05％Tween—20（或80）
2、 Tris—HCL/Tween　　　　　　　PH7。4　　　　　0。02M
1。0M　　　　　　　　　Tris　　　　　　　　　　　20ml
1。0N　　　　　　　　　　　HCL　　　　　　　　15ml
1。0N　　　　　　　　　　　HCL　　　　　　　　　　15ml　　　　　　　　　　　　调PH至7。4
Tween—2。0　　　　　　　　　　　　　　　0。5ml
DW　　　　　　　　　　　加至于1000ml
　　　　　四、底物溶液
1、 磷酸盐—柠檬酸绶冲液（NO。1）
0。1M　　　　柠檬酸：10。5g　　　C6H6O7。H2O＋DDW500ml
0。2M　　　　Na2HPO4。12H2O＋DDW1000ml
取24。3ml0。1M柠檬酸、25、7ml0。2M　　NaHPO4再加50mlDDW
注：柠檬酸溶液　及配成的底物绶冲液不稳定；易形成沉淀；因此一次不宜配制过多。
2、 OPD（邻苯二胺）底物
NO。1底物绶冲液　　　　　　　　10ml
OPD　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4mg
3％H2O2　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　40ul
3、 TMBS（四甲联苯胺硫酸盐）
TMBS贮液：10mg/ml　　　　　　DMSO　　　　　　4℃避光存放。
TMBS贮液　　　　　100ul
NO。1底物绶冲液　　　　　　　　　10ml　
1％H2O2　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　25ul
　　　　　　　　　4、0。05M　　　PH　　7。6　　　Tris_—HCL缓冲液
　　　　　　　　　　　　　　　　0。1M　　　　　　　　Tris　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　50ml
　　　　　　　　　　　　　　　　0。1N　　　　　　　　　HCL　　　　　　　　　　　　　　　　　　　38。5ml
　　　　　　　　　　　　　　　　DW至100ml
　　　　　　　　5、TBS　　　　　　buffer　　　　　　　　（NO。2
　　　　　　　　　　　　　　　20　Mm　　　　　　　　　　　　　Trisbase
　　　　　　　　　　　　　　　500Mm　　　　　　　　　　　　　NacL
　　　　　　　　　　　　　　　adjusted　　　　to　　　　　　　　　　PH7。5　　　　　　　With　　　　　　HCL
6、 DAB（二氧基苯胺盐酸）底物
DAB　　　　　　　　　75mg
NO。2底物绶冲液100ml
避光搅拌3小时；使其溶解；滤纸过滤。临用前加1％H2O2　　0。5ml
　　　　　　　　7、4—氯—1—萘酚底物（4CN）
　　　　　　　　　　　　　　　（1）　4CN贮液：3mg　　　　　4CN溶于是ml甲醇中，4℃保存；
　　　　　　　　　　　（2）　使用液：2ml　　4CN贮液＋10mlTS　buffer＋H2O2至0。01％（V/V）
7、 酶反应终止液
2m　　　H2SO4
浓H2SO4　　　　　　10ml溶于80ml　　DW
六、内源酶灭活液：
　　　　　　　　　0。01％H2O2；NaN；PH7。6　　　0。05M　　Tris—HCL绶冲液：
　　　　　　　　　取PH7。5　　　　0。05M　　Tris—HCL绶冲液98ml，加1％H2O21ml　　1％　NaN　1ml即成。
第八节 酶标抗体的制备
一、 1、　　　　　　　　　　　　　试剂
1、 0。1M　NaHCO3：0。84gNaHCO3＋DDW　　100ml
2、 0。1M　Na2CO3：1。06g　Na2CO3…DDW　100ml
3、 EPBS：同第七节
4、 10mM　NaIO4　　204。0mg　NaIO4＋DDW　100ml
5、 0。1mM　NaOH
6、 5mg/ml　NaBH4：0。1g　NaBH4＋0。1mM　NaOH　　20ml
二、 HRP直接标记腹水中单抗
1、 5mg　HRP溶于0。5ml　0。1M　NaHCO3
2、 加0。5ml　10mM　NaIO4，混匀，盖紧瓶塞
3、 室温（20℃）避光作用2h
4、 加0。75ml　0。1M　NaCO3，混匀
5、 加0。75ml小鼠腹水，混匀
6、 用少许PBS将交联物转移到一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中
7、 加Sephadex　G15或50干粉0。5g，混匀。盖紧，室温作用（避光）3h
8、 用少许PBS将交联物全部洗出
9、 收集洗出液，加1/20V新鲜配置的5mg/ml　NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟
10、 再加3/20V　NaBH4溶液，混匀，室温作用1h或4℃过夜
11、 将交联物过Sephdex　G200或Sepharose　6B（2。5*50cm）层析纯化，分管收集第一峰
12、 酶结合物质量鉴定：
（1） 克分子比值测定
酶量（mg/ml）=OD403*0。4
Ig量（mg/ml）=（OD280…OD403*0。3）*0。62
酶结合物克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量
标记率=OD403/OD280
E/P值为1…2之间合格
（2） 特异性及效价测定：应用ELISA同时确定酶结合物的特异性，酶活力，抗体活性及效价。
将酶结合物对倍稀释后平行加于阴性孔及阳性孔，合适底物显色后记录各个稀释度的特异及非特异显色值，绘制特异及非特异反应曲线，比较二条曲线可以确定其特异性，酶活力及抗体活性。特异显色为1。0时的稀释倍数，一般可作为交联物的效价。实际使用浓度应适当升高2…5倍。
13、 酶标记抗体的保存：加等量甘油（A。R）后，…20℃存放。
三、 HRP标记提纯抗体制剂：（纯化抗体请参见有关章节）
（一） HRP　的活化
1、 5mg　HRP（RZ》3。0）溶于0。5ml新配制的0。1M　NaHCO3试管中；
2、 在上述溶液中加入0。5ml　10mM　NaIO4，试管加塞塞紧，20℃暗处放置2h
3、 加0。1ml　0。1M　Na2CO3以减慢氧化
（二） 标记
1、 用0。1M　Na2CO3（Ph9。2）（1…2ml）配制15mg　Ig溶液
2、 将Ig溶液加入HRP溶液（HRP：IgG分子比为1：2）
3、 立即将IgG…HRP混合液移入5ml注射器外筒（下口塞有玻璃棉，并接上橡皮帽），加入混合液重量的1/6　　Sephadex　G25或50干粉；室温3h或4℃过夜
（三） 稳定化
1、 用少许PBS洗脱酶标记物
加入1/20V的NaBH4酶标记物中；室温作用30分钟，加入3/20V的NaBH4，室温作用1h（可与4℃过夜）
（四） 提纯同前。
（五） 酶结合物质量鉴定及保存，同前。
成功范例：酶标记大肠埃希氏菌粘附素单抗，沙门氏菌O、H抗原单抗，NDV单抗，羊抗鼠Ig抗体等。
　

第五章 免疫荧光试验程序

第一节 间接免疫荧光试验　
一、 抗原制备
1、 固定细胞片的制备：
生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4℃100％丙酮固定2分钟，空气干燥，置密封容器于—20℃保存备用；单元细胞　悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。
2、 单细胞　悬液制备：
用含0。1—1％BSA和0。1％的叠氮钠的PBS洗2—3次。注意所有各步需在4℃进行！经细胞　计数，调节细胞　浓度至10（7）/ml，可供作活细胞　的膜荧光染色。
3、 细菌涂片的制备：
将10ul细菌悬液（1X10（6）个/ml）涂沫7X21mm盖玻上，自然干燥后，用—20℃丙酮固定10—15分钟，于—20℃保存备用。
4、 病变组织触片的制备，按常规方法。
5、 病变组织冰冻切片的制备。
二、抗体染色及结果观察
1、 盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10—20ul杂交瘤上清或其它待检样品，设立阳性、阴性对照。
2、 37℃水浴　孵育0。5—1h。
3、 盖片在PBS（PH7。4；0。01M）中用磁力搅拌器洗涤15分钟。
4、 取出盖片置架上；滴加工作浓度己测定的荧光第二抗体。
5、 37℃孵育0。5—1h。
6、 洗涤15分钟。
7、 取出盖片，用延缓荧光猝灭的封载剂封存于干革命净玻片上。
8、 在荧光显微镜下观察：
阳性结果：可在细胞　浆，或细菌外周，或细菌粘附素鞭毛等可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光）。
成功范例：粘附素单抗检验，O抗原单抗检验、NDV单抗检验、NDV