实验室手册-第6章
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8、 在荧光显微镜下观察：
阳性结果：可在细胞 浆，或细菌外周，或细菌粘附素鞭毛等可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光）。
成功范例：粘附素单抗检验，O抗原单抗检验、NDV单抗检验、NDV诊断等。
附一：活细胞的膜荧光染色
1、 在小试管中加入100ul单细胞悬液后，再加100ul第一抗体，并混匀。在冰浴上孵育30—60分钟。
2、 将细胞 重新悬殊浮1—5ml洗涤剂中，以400g离心5分钟洗涤，重复一次。
3、 以100ul洗涤剂悬浮，加工厂100ul荧光抗体，置冰浴30—90分钟。
4、 洗涤2次
5、 将细胞 重新悬浮于20—30ul含水量10％ 甘油，10—100ug苯二胺（）ml的洗液中（PH7。0左右）滴于载玻片上；加盖玻片封载。
6、 立即在显微镜下检查；细胞亦可在染色后用1％多聚甲醛生理盐水固定；立即检查；或至少在4℃可保存一周。
成功范例：NDV单抗膜荧光染色
附二：
1、双重染色：标本中有两种不同抗原；可用FITS和RB200；分别标记 两种抗体；同时或先后反两种荧光抗体进行染。 2、反衬染色：对于组织标本，为了加强特异性荧光的鲜明性，常需使用反 衬染色。最常用者为伊文氏蓝（1：10000—1：100000），它发射红色荧光，可反衬出FITC的黄绿色荧光。
附三：
1、 PH7。4 0。1M磷酸缓冲液
Na2HPO4。12H2O 28。94g
KHPO4 2。6g
DW 1000ml
应用时取上述贮存液100ml；加入NaCL8。5g；加DW至1000ml；即为PH7。4 0。01M PBS。
2、缓冲甘油
SoL。Ι
甘油（A。R。） 9份
PBS 1份
SoL Ⅱ
甘氨酸 0。42g
NaOH 0。021g
NaCL 0。51g
NaN 0。03g
D。W。 至30ml
加入 70ml
第二节 直接免疫荧光试验
1、 抗原制备同前
2、 加染荧光素标记的特异抗体。
3、 37℃温育30—60分钟。
4、 洗涤15分钟。
5、 取出盖片，完全干燥后，用封片油封于干净的勒玻片上。
6、 镜检
成功范例：沙门氏菌快速检验，NDV诊断。
第三节 荧光抗体的制备
一、 试剂
1、 PH9。3碳酸盐缓冲液
无水Na2CO3 8。6g
NaHCO3 17。3g
D。D。W 1000ml
2、 PBS（PH7。4，0。01N）同前
3、 二甲基亚砜
二、标定程序
1、 以碳酸盐缓冲液调整蛋白浓度至10mg/ml；（腹水单抗可直接用碳酸盐缓冲液稀释；提纯的抗体IgG，需经SephadexG25柱层析或透析方法转换缓冲体系至碳酸盐缓冲液）。
2、 取代5ml抗体溶液于10ml小烧杯内，磁棒轻搅。
3、 称取1mlFITC溶解于0。2mlDMS中。
4、 待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内。
5、 20℃闭光作用2h，可不搅拌。
6、 将交联反应后的溶液经SephadexG25或G50柱析层除去游离的荧光素。
7、 收集第一峰为标记的抗体。
三、FITC结合物质量鉴定
1、 测定F/P比值：
OD100…0。35XOD495
＇IgG＇（mg/ml）=——————
1。4X
F/P=2。87
抗IgG荧光抗体F/P比不宜高于1…2；抗细菌荧光抗体F/P可允许高于2，乃至高标记（F/P10——15）。
2、 特异性及效价测定
以标记抗体染色各种抗原的盖片，同时测定其特异染色滴度和非特异染色滴定，并观察抗体活性。
四、标记抗体的保存
标记抗体宜保存于4℃；
或加50％甘油（A。R），…20℃冻存。
成功范例：沙门氏菌O抗原单抗标记，羊抗鸡IgG的标记抗体的制备等。
第六章 间接血凝试验的程序
第一节 脂多糖敏化甲醛化绵羊红细胞的制备
一、 甲醛化绵羊红血球制备：
（一） 醛化血球试剂：
1、PH7。2 PBS
NaHPO4。12H2O 3。5816g
KH2PO4 0。4082g
NaCl 8。014g
D。W。 1000ml
3、 双倍离子强度的PH7。2PBS
Na2HPO4。12H2O 0。3581g
KH2PO4 40。82g
NaCl 0。814g
D。W。 50ml
4、 抗凝保存液（即Alsever氏液）
枸椽酸钠 0。8g
枸椽酸辣 0。055g
氯化钠 0。42g
葡萄糖 2。05g
D。W。 1000ml
5、 甲醛（A。R。或C。P。）：临用前用双倍离子强度的PBS作对稀释；配成20％的甲醛。
6、 饱和硫酸铵溶液：按25℃饱和溶解度配制。
（二）、步骤：
1、 无菌采集绵羊颈静脉血50ml，用要枸椽酸钠作抗凝剂；
2、 用5倍于红细胞压积的PH7。2PBS充分洗涤5次；每次1500rpm5___10分钟；直至上清测定无蛋白质（用饱和硫酸铵滴定上清；观察有无白色沉淀）；再以相同缓冲液配制成25％SRBC悬液；
3、 25％SRBC与20％甲醛以25：1的比例混匀；37℃水浴作用2小时；每15分钟振荡一次；红细胞颜色由红色转变为棕色；
4、 取出；以PH7。2PBS洗涤4次；每次2000rpm10分钟；再加同样的PBS；制成25％SRPB；
5、 重复第三步醛化一次；同法洗涤；
6、 最后配制相当于20％醛化SRBC悬液；并加入侵。3％甲醛（最终浓度）或者0。01％硫柳汞防腐；分装；4℃保存备用。
二脂多糖抗原制备___热酚水法
1、 菌泥悬浮于100ml水中，或20g菌粉悬于350ml水中；
2、 将新配的90％（V/V）苯酚（最好是新蒸的）预热至68℃—70℃；
3、 加酚液于菌液中，至酚的最终浓度为45％，68℃水浴作用25分钟，并充分振荡；
4、 冷却至10℃左右，12000rpm30分钟，离心管内分层情况依次是：水层、蛋白质层、酚层和沉淀物。
5、 小心吸取上清，（准备透析袋）
6、 余下部分再加水80ml，68—70℃水浴维持30分钟，冷却至0℃左右，离心吸水层；
7、 将水层提取物装入透析袋，流水透析1天，蒸馏水透析2天；
8、 收集粗品LPS，冻存备用。
三、蒽酮比色定糖法—测定粗制LPS的多糖含量。
1、 原理：蒽酮可以和游离的或多糖中存在的己糖果，醛戊糖及己糖果醛 酸起反应，反应后溶液显蓝绿色，于620nm处有最大吸收。
2、 试剂：
（1） 2g/L蒽酮试剂 ：溶解2克蒽 酮于浓硫酸（A。R。 d=1。84；95％）；宜当日配制使用。
（2） 0。1g/L葡萄糖溶液或0。1g/L糖元溶液。
3、实验步骤
（1） 标准曲线制备
管号 1 2 3 4 5 6 7 备注
标准葡萄糖液 0。05 0。10 0。20 0。30 0。40 0。60 0。80 置水浴中
蒸馏水 0。95 0。90 0。80 0。70 0。60 0。40 0。20 置水浴中
蒽酮试剂 3。0 3。0 3。0 3。0 3。0 3。0 3。0
沸水浴 蒽酮 加入后，将试管移入沸水浴 ，煮沸10分钟，冷却至室温
测定OD820值
含糖量 5 10 15 20 25 30 35
绘制标准曲线：以OD820为纵坐标，糖含量（ug/ml）横坐标绘制标准曲线。
或以统计方法，求出糖含量与OD820之间的相关系数，及直线回归方程。
（2）样品含糖量测定：
取1ml稀释的粗制LPS，加速度。3。00蒽 酮试剂；混匀后迅速置于冰浴 冷却。然后转入沸水浴 中煮沸10分钟表（与制备标准曲线同时进行）。冷却至室温后，测定OD820，从标准曲线中查找相应糖含量，或代入回方法求得糖果含量。
四、脂多糖抗原致敏甲醛化SRBC
1、 取粗制LPS，加0。2M PH8。0 PB液；调整多糖浓度至120ug/ml；100℃水浴 1小时。
2、 冷却至少37℃；
3、 配制6％醛化SRBC溶液；
4、 将热处理LPS与醛化SRBC等量混合；37℃搅拌作用45分钟；
5、 取出离心2000rpm10分钟；以0。01M PH7。2PBS洗澡4次；
6、 配制4％致敏血球；分装；保存于4℃备用。
7、 致敏血球质量鉴定：
（1） 自凝性测定：血球制备过程中，洗涤不彻底，或过度化等，都可引起血球的自凝。
（2） 特异性测定：与不同抗体试剂反应，确定其反应特性。
（3） 工作浓度测定 ：选择最佳最省的致敏SRBCIPYA。
附0。2MPH8。0PB溶液。
基础液A 0。2Mna2HPO4
Na2HPO4。2H2O（MW353。22） 35。61g
或 Na2HPO4。12H2O（MW352。22） 71。6g
DW 1000ml
基础液B 0。2M NaH2PO4
NaH2PO4。H2O（MW138。01） 27。6g
或NaH2PO4。2H2O（MW156。03） 31。21g
DW 1000ml
使用液： A液94。7ml ＋B液5。3ml
成功范例：沙门氏菌脂多糖抗原敏化SRBC制备；及其在单抗检测、鸡白痢等检疫中的应用。
第二节 蛋白质敏化SRBC的制备
一、 双醛化红细胞制备
1、 采绵羊抗凝血；
2、 用10倍于红细胞 压积的0。11MPBS（PH7。2）洗4—6遍；
3、 用同一PB配成8％SRBC；
4、 配制醛 化试剂：
丙酮醛 3ml
甲醛 6ml
0。11MPB液（PH7。2） 94ml
5、 将醛化试剂缓慢加入等到量的8％SRBC中；
6、 室温（20℃）缓慢搅拌17小时；
7、 PB洗三次；
8、 配成20％双醛化SRBC，加0。1％NaN2防腐；4℃保存备用。
附：醛化红细胞 的鞣酸处理亦能吸附蛋白；但其敏感性很低；经鞣酸化后；红细胞 吸附蛋白质的量显著增加；但同时加强了红细胞 的不稳定性；（请根据要求确定是否要鞣 酸化）。；容易自凝；但增强了反应的敏感度。可用1％正常免疫血清稳定之。
1、 将醛化红细胞 配成2。5％悬液；
2、 加入新鲜配制1：10000稀释的鞣 酸溶液 ；
3、 混匀后置37℃水浴15分钟；
4、 洗涤后再配成品2。5％悬液。
二、 抗原致敏
1、 取20％双醛 人红细胞 01ml；1500g离心弃上清
2、 ；沉积红细胞 加0。2M PH4。醋酸—醋酸钠缓冲液1ml，并加最适浓度（预先要测定，蛋白抗原为50ug/ml左右）的抗原1ml
3、 混匀，于45℃致敏35分钟，不时轻轻摇动使红细胞 不下沉；
4、 离心弃上清，并用20倍红细胞 压积的PB 洗4次；
5、 配成1％致敏血球，4℃冰箱保存备用。
成功范例：粘附素致敏感SRBC。
第三节 PHA试验程序
1、 V型微量血凝板上每孔加入PH7。2PBS稀释液25ul（一滴）；一个样品做一排；
2、 加入25ul杂交瘤培养上清液或其它待检血清；依次作倍比稀释；同时设立阴性；阳性对照；
3、 再加入0。5—4％致敏血球1滴；
4、 将血凝板在振荡器上，振荡30秒；
5、 置室温半小时观察结果。
第七章 免疫胶体金试验程序
1、 取样：铜网沾取细菌悬液（80亿/ml）；
2、 漂洗：PH7。4 0。05M TBS；三次；每次5分钟；
3、 第一抗体（单抗）反应：与一定稀释度的抗体应；37℃半小时；
4、 PH7。4 0。05M TBS漂洗
5、 ；与兔抗鼠IgG37℃作用半小时；
6、 先PH7。4 0。05M TBS漂洗三次；每次分别再用PH8。2 0。02M TBS漂洗三次；每次5分钟
7、 ；与羊抗兔胶体金（陕西省中医药研究院）（1：10）稀释液作用，4℃过夜，（或用SPA胶体金，宁军区医院）；
8、 先用PH8。2 0。02M TBS漂洗三联单次；每次5分钟；再用PH7。4 0。05 TBS 漂洗；每次5分钟；
9、 晾干后电镜观察。
成功范例：大肠埃希氏菌粘附抗原定位；沙门氏菌O抗原、H 抗原定位。
附：
一、负染色：常规电镜负染色法，细菌悬液浓度8亿/ml，1％PTA染色30秒钟。或铜网经0。02％GA室温处理30分钟；然后吸干；滴加培养菌液或提取抗原；用1％磷钨酸染30秒；晾干后电镜观察。
二、免疫酶染色：
1、 同前
2、 同前
3、 同前
4、 与羊抗BALB/C小鼠IgG酶标抗体作用，37℃半小时，经PH7。4 0。05M TBS漂洗后；与底物溶液作用5—10分钟，漂洗，晾干后电镜观察。
附：1、底物溶液：PH7。6 0。05M Tris—HCL缓冲液
0。125％ DAB
0。03％ H2O2
3、 1％BSA：以PH7。4 0。05M TBS配制
第八章 免疫球蛋白亚类测定的程序
第一节 免疫扩散法
单抗类和亚类鉴定的常用方法
一、 试剂
1、0。06M巴比妥钠—盐酸缓冲液 PH8。6
（1） 0。06M巴比妥钠（MW 206。18） 1。237g
D。W 100ml
（2） 0。2N盐酸溶液
浓盐酸 1。68ml
DW 至100ml
（3） 0。06M巴比妥钠—盐酸缓中液PH8。6 取（1）液化气100。00ML；用力。2N盐酸溶液调节PH至8。6（大约用4。00ml）
2、1％agarose
agarose（B。R。） 0。8g
0。 06M巴比妥钠盐酸缓冲液80。0ml
隔水煮 沸溶化。
5、 羊抗小鼠IgG亚类血清
IgM， IgG，IgG32，IgG24，IgG2
二、 方法
1、 浇琼脂糖板，每片约3ml；
2、 琼脂糖板打孔（孔径为1—2mm，孔间距离3—5mm），挑出孔内琼脂后，补孔；
3、 向中央孔注入抗Ig亚类抗血清，周围孔加入待测样品（1：20稀释腹水样品，或20倍浓缩的培养上清），每孔2—3ml；
4、 置湿盒内室温下扩散或4℃过夜观察沉淀线，判定结果。
附：（1）20倍浓缩的杂交瘤培养上清的制备。最简单方法是将20ml培养上清倒入一平皿，电扇砍风蒸发浓缩至于ml，或装过透析袋，用PEG6000或蔗糖吸水；
或以浓缩胶吸收上清中水份。
单克隆浓缩抗体是上清中在的叭一的小鼠Ig，因此，浓缩培养上清是鉴定Ig�
