实验室手册-第9章
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2、 每一平方厘米涂膜的视野数应为
AF 1cm（）
——— =——————
Af Af＇cm＇（）
3、 每个涂膜含0。01ml样品；则1。0ml样品的视野数应为：
AF
FF=100X————
Af
4、 每ml样品中的菌数即为：
DMSCC（）/ml=＇FF＇X＇每个视野的平均菌数＇
（direct microscopic somatic cells count 直接显微镜菌体细胞计数）
5、 FF和检查的视野数（至少10—60个）都为已知数，故可作为一个系数，称视野工作系数（FWF）代入上式而得：
DMSCC/ml=＇FWF＇X计数的总细菌数
6、 菌液涂膜的制备：
（1） 吸0。01ml样品；置于洁净、干燥的载玻片上；
（2） 将菌液涂成1cm（）的涂膜；
（3） 将玻片放于35—40℃，至涂膜干燥；注意保持玻片的水平。
（4） 浸于二甲苯中1min，再浸于95％酒精中1min；
（5） North苯胺油亚甲蓝染色剂中染色1—20min；
7、 漂洗玻片，镜检前在空气中充分干燥。切忘用吸墨纸吸干。
附：North苯胺油—亚甲蓝染色液
苯胺油（Aniline Oil） 3ml
酒精（95％） 10ml
盐酸（浓） 1。5ml
亚甲蓝（饱和溶液） 30ml
蒸馏水；加至 1000ml
将3ml苯胺油与10ml酒精相混合；在不停在搅拌下徐徐加入1。5ml盐酸。。加30ml饱和亚甲基蓝溶液，用水稀释至100ml，过滤。
四、 分光光度计测定法
a、 波长选择420nm，550nm，600nm。
b、 下列回归方程为420nm条件下建立。
第一组
（1） 大肠杆菌
lgy（）=7。1370＋2。7878X
（2）金黄色葡萄球菌：
lgy（）=7。4722＋4。7259X
（3白色葡萄球菌：
lgy=6。9067＋2。6950X
（5） 白色念珠菌：
lgy=5。9512＋2。1948X
有效测定范围在103___106ofe/ml
（摘自俞晓峰文章）
第二组
（1） 沙门细菌（S。pullorm）
未离心肉汤：lgy=7。3461＋7。5306X
离心菌悬液：lgy=7。3112＋7。7191X
（2） 大肠杆菌：
未离心肉汤：lgy=7。4197＋1。2113X
离心菌悬液：lgy=7。3764＋5。8632X
五、最近似数（MPN）（the most probable numbers）是一个代表作用物中活菌浓度的估计数。这个数是应用机率的原理测定作用物（样品）中细菌的总浓度而推知的。请参阅有关文献。
第二节 几种常用细菌培养基的配方
一、Minca Med 1000ml（Minca—Isoritalex）
KH2PO4 1。36g
NA2HPO4。12H2O 25。3g（NA2PO4。12H2O 10。1g）
Casamino acids 1g （Difco）
Trace salts solution’ 1ml’
agar（Difco） 12g
PH7。5 10P。10分钟消毒
（Isoritalex（BBL）：1 ampoule）
*Trace salts solution（100ml）
MgSO4。7H2O 10g
MnCl2。4H2O 1g
FeCl3。6H2O 0。135g
CaCl2。2H2O 0。4g
100℃灭菌。
二、SLANETS MEDIUM
Bacto tryptose 20g glucose 1g
NaCl 9g bacto agar 18g
A．D．W 1000ml
四、 BBL培养基
（1）大豆胨 10g
Trypton or Bacto—pepton
orpretose—pepton 10g
NaCl 4g
KH2PO4 1g
牛肉汤 1000ML
agar 20—30g
PH7。6 15磅 15分钟灭菌
或（2）Trypton or Bacto—pepton 10g
NaCl 3g
NaH2PO4 2g
兔汤 500ml
牛肉汤 500ml
agar 20g
PH7。6 15P15’
或（3） 酪蛋白水解物 20g
大豆胨 10g
NaCl 3g
NaH2PO4 2g
PH7。6 15P 15’
四、TEM Med
Lab__Lemco 5g
bacto__tryptose（Difco） 10g
NaCl 3g
Na2HPO4。12H2O 2g
glucose 0。5g
yeast extract（Difco） 5g
*Trace element solution 5。0ml
PH7。3
bacto agar（Difco） 25g
A。D。W 1000ml
120℃ 15’
*Trece ekement salt
FeSO4。7H2O 0。5g
ZnSO4。7H2O 0。5g
MgSO4。3H2O 0。5g
1N H2SO4 20ml
A。D。W 1000ml
五、 M肉汤
1、Trypticase soy Broth
Trypticase 17。0g
phytone 3。0g
Glucose 2。5g
15p。s。i for 15min
Dipotassium phosphate 5。0g
D。W 1000ml
PH7。3
2、Tryptone Broth
Trytone 10。0g
D。W。 1000ml
3、M broth
an equal mixture of（1） and （2）
六、 其它各类培养基参见有关书籍。
第三节 常见细菌的分离鉴定
按常规程序进行各类细菌分离鉴定，请参阅有关书籍。这里仅以肠杆菌科沙门细菌的分离鉴定为例简要概述，下面是该菌的分离鉴定的流程图：
被检材料
内脏组织上 粪便、肠内容物理学 各类食品、饲料等
前增菌
增菌培养（24—48小时）
选择性增菌
鉴别培养基（24h）
三糖铁琼脂（24h）
几次常规生化 尿素酶 多价抗O血清
试验鉴定 测定 试验
ELESA试验、
结果判定 FA试验、噬菌体系统
DNA杂交试验等
动物试验 O单因子血清测定 鉴别生化试验
H血清鉴定
结果判定
第十一章 细胞免疫学试验程序
第一节 玫瑰花环试验（E—ROSETTES ASSAY）
一、总E花环（ERYTHOCYTE TOTAL ROSETTE，Et），或称晚期玫瑰花环，淋巴细胞＋SRBC等，37℃，低速离心——4℃ 2小时——检测。
E的百分率（花环形成的细胞X100/总计细胞数）和绝对数可代表被检标本中全部T淋巴细胞的百分数和总数。E是目前鉴定和计算外周血液和各种淋巴样组织中T细胞的最常用方法之一。
二、活性E花环（ERYTHOCYTE ACTIVE ROSETTE， Ea），或称早期玫瑰花环。淋巴细胞＋SRBC或其它动物红细胞——低速离心沉淀——检测。
Ea与T细胞的体内外功能活性密切相关，能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平最为简便快速的方法之一。
三、 操作步骤
1、 静脉采血，以肝素作为抗凝剂，每毫升血含20UL或0。2mg；若为以EDTA—Na2作抗凝剂1—2mg/ml血。一般认为EDTA—NA2比肝素好，因为T淋巴细胞、RBC、肝素均带负电，有相互排斥。
2、 淋巴细胞的分离 淋巴细胞比重在1。077___1。080之间；红细胞和粒细胞比重为1。092。配制1。077___1。080高分子液进行密度梯度离心；高分子溶液的主要成分是蔗糖；商品名为FICOLL
取抗凝血1。0ml；加等量HANK’S液（无钙镁；PH7。4）稀释后；用毛细吸管沿管壁缓慢加入装有淋巴细胞分层液的试管内；使血凝重叠于分层液上；用水平离心机以2000R/M30分钟离心。此时红细胞沉降至最下层，上层为血浆，中层为分层液，血浆与分层液的界面有一白色挟带为淋巴细胞和单核细胞。
以毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单核细胞，置于离心管中，用HANKS液以1000r/m10分钟洗2次，以HANKS液配成107个细胞/ml的细胞悬液。
3、1％RBC悬液的制备 取阿氏液保存的血液，以HANKS液洗3次，2000r/m10分钟离心后，将压积红细胞用HANKS液配成1％悬液，含红细胞数约108/ml。
6、 Ea花环0。3ml淋巴细胞悬液＋1％RBC 0。3＋0。1ml灭活小牛血清___混匀___37℃25分钟___1500r/m5分钟___此培养物即可作涂片或滴片观察。
5、E1花环：上述培养物中再加入0。8％戍二醛1滴；轻轻摇匀混合；置4℃冻箱中作用2小时（或过夜）。取出后，轻轻旋转试管，使沉淀的细胞重新悬浮，用毛细管轻轻混匀。
7、 制片镜检
（1）湿片 取上述培养物一滴加于事先铺有瑞氏染液的玻片上，覆以盖玻片，在高倍镜或相差镜下观察。凡吸附4个或更多RBC的单核细胞为RE花环形成细胞，共计数200个细胞，算出百分率。
（2）干片 取培养物1滴于载玻片上涂片、干燥，滴加甲醇固定5分钟，用PH6。4PBS冲洗；取I液染4分钟；冲洗；再加II液染色4分钟；冲洗；待干；镜检。红细胞染成红色，淋巴细胞染成蓝色。
附1 染液配方
I液 瑞氏粉0。1g；甲醇60ml；研碎混匀。
II液 姬姆氏粉0。5g；纯甘油33ml；甲醇33ml；先将姬姆氏粉溶于甘油中；并置60℃温箱中；最后加甲醇即可。
使用时；分加将I液和II液用PH6。4PBS稀释一倍。
附2 试验条件选择
1、 人、猪、牛、羊淋巴细胞——SRBC：
2、 马、犬淋巴细胞—豚鼠RBC：
3、 豚鼠淋巴细胞——家兔RBC：
4、 RBC：LC=50—100：1
5、 染液亦可用0。2％美兰； Giemsa ___Wright氏液。
第二节 淋巴细胞转化试验
（LYMPHOCYTE TRANSFORMATION TEST）
淋巴细胞转化试验是体外检测淋巴细胞功能的一种方法。Tc与特异性抗原或非特异促分裂因子在体外共同培养时，细胞代谢和形态发生一系列的变化，代谢旺盛、蛋白质和核酸的合成增加，细胞体积变大，转化为能分裂的淋巴母细胞。转化率的高低反映机体的免疫功能状态，这种方法为淋巴转化试验。
一、试剂配制：
1、 DMEM＋10％FCS
2、肝素2000U/ml
（4万单位溶于20mlPBS，过滤除菌；使用时0。1ml肝素＋10ml血）
3 无Ca＋＋、Mg＋＋，PBS，灭菌
4、0。2％台盼蓝
5、PHA80ug/ml
0。8mgPHA＋无菌10mlDMEM＋10％FCS中；
6、H—THYMIDINE
1mCi/ml的液体0。5ml___溶于50mlDMEM＋FCS液中；终浓度为1uci/100ul。
7、消化液20ml
浓甲酸 15ml
H2O2（30％） 5ml
8、液闪液（所有器皿需烘干）
PPO 5g
POPOP 2。5g
溶于200ml无水乙醇＋800ml甲苯；摇匀；
9、MTT
二、外周血淋巴细胞PBM制备
1、 10ml肝素抗凝血；
2、 50g，4℃10—15min；
3、 收集上层液体；
4、 用DMEM＋10％BFS洗一次；
400g 4℃ 10min；
5、 吸弃上清，加5mlDMEM＋10％BFS；
6、 活细胞计数（方法见前）
调整细胞浓度至2X107/ml
三、同位素法测定转化后的细胞活性
1、按下列方式分别加入淋巴细胞悬液和PHA：
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
（1） 淋巴细胞浓度2X107/ml，每孔加入0。5ml；终浓度为1X107/ml；
（2） PHA浓度80 40 20 10 5 0ug/ml；每孔加入0。5ml；终浓度为40 20 10 5 2。5 0；
2、 37度CO2箱内培养56h；
3、 A、B两排每孔加1uci、’H…thymidine；
4、 继续培养16小时；
5、 收集A、B、C排细胞于离心管内；
6、 400g10min，弃上清；
7、 A、B排细胞沉淀用PBS洗一次，400g×10min；
8、 放射性测定；
（1）A、B离心馆开盖80度烘干，2…3小时；
（2） 每管内加消化液200ul；
（3） 盖好，90度水浴1小时；
（4） 每管取100ul置液闪瓶内；
（5） 每瓶加4ul闪烁液
（6） 液闪仪测定
刺激指数SI= 加PHA管的CPM均值
——————————————
对照管CPM均值
四、形态学方法：
1、 C排管内细胞沉淀物涂片
2、 GIEMSA——WRIGTH染色
3、 镜检
200个LC；计算转化率
转化率（％）=转化LC/淋巴细胞总数
五、 MTT法
MTT法是一种四甲基偶氮唑盐＇3—（4。5… dimethyl__thlazd…2…yl）…2。5…diphenyl…terrazolium bromide＇淡黄色，易溶液于水，MTT经活细胞线粒体中的脱氢酶作用后可氧化成蓝色结晶甲遥滓｛经异丙醇作用后溶解显色，此法简易，准确且无同位素污染，以此法代替H’—TDR掺入法可进行细胞代谢活性及增殖反应的测定。
1、 不同处理的细胞加入96孔细胞培养板中，每孔100ul，37℃6％CO2培养。
2、 培养结束前4小时加入100ul/孔MTT试剂。
3、 培养结束后，取出培养板，4℃下1500r/m离心7分钟，甩去上清。
4、 立即加入10％盐酸一异丙醇，100ul/孔，充分吹吸混匀。
5、 于DG一3022型酶联免疫仪上测定OD570nm、OD650nm，求出OD550值。
第十二章 动物实验的一般规则
一、 依据实验目的要求，如病毒LD50、LD100、ID50等、细菌毒力测定、免疫效力试验、免疫血清制备等，选择不同种类、品系及不同饲养管理条件下的实验动物式实验用动物。常用的实验（用）动物包括小白鼠、大白鼠、豚鼠、绵羊、山羊、小香猪、他猪八戒、家兔、鸡、鸭、鹅等十几种。其中部分动物又有自然繁殖、近交系等、SPF与非SPF等区分。
二、依据动物骒病原体的敏感性或骒接种物的应答性不同，确定选用动物的年龄、性别，特别是使用动物的数量。
四、 不同实验研究类型所要求的动物数量不相同，现简述如下：
（一） 现况研究（Cross…sectional study）的一般样本大小可用下列公式计算：
S．E．=PQ/N
S．E．=标准误，P=某病的现患率或感染率，Q=1…P，N为样本大小。根据上述公式，可得到下列简便公式。
1、 若容许误差d=0。10P；95％可信水平t=2样本的感染率P与总体感染P之间有差异d。P…p=＋（…）d=＋（…）txS。E；S。E。=d/t。0。05水平；自由度为无限大时；t值约为2
