普通遗传学-第15章
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Benzer通过互补分析发现T4噬菌体rⅡ突变型可分为rⅡA和rⅡB两组（图5…13），一组中的任何成员可与另一组中的任何成员互补。他的遗传分析结果证明，所有rⅡA突变型在rⅡ区的一端从A1到A6，所有rⅡB突变型在rⅡ区的另一端从B1至B10，因此他正确得出结论，rⅡA和rⅡB区是分开的功能单位，通过互补试验把它们定义为顺反子（cistron）。顺反子是一个必须保持完
整才具有正常功能的遗传物质的最小单位，等同于基因。
图5…14 互补测验或顺反测验示意图
另外，还必须提到基因内互补，即某一个基因内部的不同位点的突变型之间也有互补作用。区别基因间互补和基因内互补的标准是：①基因间互补可发生在任何2个非等位基因之间，基因内互发生在同一基因内的若干不同的突变型之间，但同一基因产生的绝大多数突变是不能互补的。②互补突变型产生的酶在性质上不同于野生型产生的酶，它至多只有野生型活性的25％。
对基因内互补的种解释是，许多蛋白质是由2条或几条相同的多肽链聚合而成的，突变引起多肽亚基上一个氨基酸代换，使该亚基的三维空间构型发生变化，不能聚合产生一个有活性的酶（图5…15）。某一基因的2个突发型虽然各自产生一个发生了变异的多肽，却不能自身聚合成有活性的酶；但是当它们结合在一起时有可能互补形成一个有活性的酶。沙门氏菌中的甘油磷酸脱氢酶的基因，大肠杆菌和链孢霉中色氨酸合成酶的基因，链孢霉中谷酰脱氢酶基因都有基因内互补的现象。
图5…15 基因内互补
3种型式表示野生型和2种突变型产生的蛋白质亚基的三维空间构型。只有当
2个亚基聚合时才能产生有活性的酶。
（a）蛋白质亚基的三维空间构型使它们能聚合形成有活性的酶蛋白复合分子
（用圆圈表示） （b）亚基改变了三维空间构型，不再能聚合形成有活性的
酶。 （c）另一个突变型可能以不同方式改变三维空间构型，但亚基也不能
聚合形成有活性的酶。 （d）当2个突变基因结合在一个异核体内时，2种
类型的亚基能聚合形成活性减小的酶。只有50％的亚基对能够互补，另外50％
同类相配，没有活性。
5。2。4 负干扰
在第4章中已论述了在三点测验时，一个单交换发生后，在它邻近再发生第二个单交换的机会就会减少，即一个单交换会降低另一个单交换发生的概率，这种现象称为干扰（interfer…ence）。对于受到干扰的程度可采用符合系数（C=实际双交换值/理论双交换值）或干扰系数（I=1…C）来加以衡量。干扰系数为1时，表示安全的干扰，即一点发生交换，其邻近一点就不会发生单交换。干扰系数为0时，表示2个单交换独立发生，完全没有干扰。在λ噬菌体的三点测验中，发现一
个单交换发生后，会增加另一单交换发生的概率即所谓负干扰（nega…tive interference）现象，这时干扰系数为负值，或符合系数大于1。表5…2是T4噬菌体三点测验资料，根据第4章三点测验的方法可以画出T4噬菌体包括3个基因的染色体图，但不同的是符合系数在于1而不是小于1，表明m…r之间的单交换可提高r…tu单交换发生的概率或者相反。
表5…2 大肠杆菌噬菌体T4的三点测验（m r tu×＋＋＋）结果
基因型 噬菌斑数 百分率/％ 基因型 噬菌斑数 百分率/％
1。m r tu 3 467 33。5 5。m r ＋ 853 8。2
2。＋ ＋ ＋ 3 729 36。1 6。＋ ＋ tu 965 9。3
3。m ＋ ＋ 520 5。0 7。m ＋ tu 162 1。6
4。＋ r tu 474 4。6 8。＋ r ＋ 172 1。7
负干扰后来在真核生物如家蚕、真菌中也都有发现。负干扰的发生可能与基因转变（gene conversion）有关，往往重组基因相距很近或发生基因内重组时会出现负干扰。
5。3 细菌的细胞和染色体结构
细菌的细胞包括细胞膜、核区、细胞质和细胞壁。部分细菌还有某些特殊结构，如鞭毛、伞毛、荚膜、芽孢和气泡等（图5…16）。细菌是单细胞生物，完成每个世代只需20min，而且很容易得到它的生化突变型。遗传物质又比较简单，适宜用作基因结构和功能的研究。细菌的大小不一，大肠杆菌的平均长度约2um，宽约0。5um。常见的细菌细胞的形状有杆状、球状和螺旋状，其中以杆状最为常见。
细菌细胞与真核细胞之间有2个基本差异。首先，原核细胞缺乏线粒体、叶绿体等细胞器。第二，原核细胞没有核膜，因此也没有界限分明的细胞核。
细菌无真正的细胞核，只是在菌体中央有一个大量遗传物质DNA所在的核区，称为拟核，其功能与细胞核相当。核区无核膜和核仁，由一个环状DNA分子高度缠绕而成，其中央部分还有RNA与支架蛋白。
细菌DNA是一个很长的共价闭合环状双链分子，通常为经过反复折叠形成高度缠绕的致密结构——超螺旋，能存在于长度仅有DNA几百万分之一的菌体中。例如，大肠杆菌染色体长约1mm，但其菌体长仅2～3um。细菌无典型的染色体结构，没有组蛋白与DNA结合，DNA仅与一些碱性蛋白相结合。此外，细菌染色体DNA中有一定比例（约1％）的碱基甲基化，其中以腺嘌呤居多，胞嘧啶次之。
除染色体DNA外，很多细菌还含有一种染色体遗传成分——质粒。这是一些小型环状DNA，携带着决定细菌某些遗传特性的基因，如接合或致育、抗药、产毒、致病等以及产生抗生素和色素等次生代谢产物或形成芽孢的基因。质粒能独立于染色体存在和复制，很多质粒还能在细胞之间传递。它们也会自行或经某种理化因子处理而消失。有的质粒还能整合到染色体中，在染色体的控制下与染色体一起复制，这种质粒称为附加体（episome）。
影印培养法是细菌和病毒遗传研究的常用方法。其基本原则是：把长有许多菌落的母培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的圆木柱（直径略小于培养皿）上，然后把这一“印章”上的细菌一次接种到一系列选择培养基平板上。经培养后，通过对各皿相同位置上的菌落作对比，就可选出适当的突变型（图5…17）。
图5…16 细菌细胞的结构 图5…17 细菌的影印培养技术
某些结构如荚膜、鞭毛、孢子和伞毛等不是所有细胞都具有的
（a）革兰氏阳性细菌 （b）革兰氏阴性细菌
5。4 细菌的染色体作图
5。4。1 接合
5。4。1。1 接合现象的发现
1946年，J。Lederberg和E。Tatum设计了一个研究细菌基因重组的试验。他们选用大肠杆菌K…12的2种不同营养缺陷型菌株即甲硫氨酸（met ）、生物素（bio ）的营养缺陷型和苏氨酸（thr…）、亮氨酸（leu ）、硫氨素（thi…）的营养缺陷型。“＋”代表原养型或抗性，“…”代表营养缺陷型或敏感型。
菌株A的基因型为：met… bio… thr＋ leu＋ thi＋ ；只能在补充有甲硫氨酸、生物素的培养基上基上生长。
菌株B的基因型为：thr… leu… thi… met＋ bio＋ ；只能在补充了苏氨酸、亮氨酸和硫氨素的培养基上生长。
在这一实验中，他们将2种细菌都涂布到基本培养基中培养，其中有些平板只涂布菌株A，有些平板只涂布菌株B，有些则涂布预先在液体完全培养基中培养了数小时的A株和B株的混合物（图5…18）。经培养后发现，只有在混合培养平板上长出了菌落，其频率为1×10…7，而在单独培养A菌株和B菌株的培养基上生长，因此这一试验表明这2个菌株的基因组之间可能发生了某种形式的基因重组。
图5…18 Lederbeng和Tatum的细菌结合试验
这种原养型菌落是如何产生的呢？由于Lederberg和Tatum用的是多重营养缺陷型，因而就可以排除发生回复突变的可能性。单个基因的突弯率在10…6。2个或2个以上突变型同时发生突变，回复突弯率都小于10…12，这在基本培养基上几乎不可能获得菌落。那么是否发生遗传转化呢？1950年；B。Davis设计的U形管实验否定了这一推测。他在一根U形管底部用超微孔滤片隔开，将A和B菌分别注入两臂中（图5…19）。这种滤片使大肠杆菌不能直接接触，但可以允许大约0。1um以下的分子通过。他在U形管的一端通入灭菌空气或用吸气方法使培养液从一端经过滤片透到另一端，使两边的培养基较好地相通。培养一段时间后，取出两端的细菌并分别涂布于不同的基本培养基上，也没有任何原养型菌落出现。这一试验证明A菌株和B菌株细胞之间的直接接触或称结合（conjugation）是基因重组的前提。
图5…19 戴维斯（Davis）的U形管试验示2个细菌之间的物理隔离
5。4。1。2 F因子及F因子的转移
1952年，W。Hayers用链霉素处理前述A菌，然后再将A菌与B菌杂交，所生成的原养型重组体的数目没有减少；反过来，用链毒素先处理B菌，再与A菌杂交，可以完全阻止重组作用的发生，这说明细菌接合中遗传物质转移是一种单向过程即遗传物质从A株转移到B株。因此人们把细菌分为2个类群，即2种接合型，一种为供体或雄性菌，另一种为受体或雌性菌。决定雄性的是染色体外的一个共价环状的DＮＡ分子，称为致育因子（fertitility factor）或Ｆ性因子，也称为Ｆ质粒。雄性供体细胞以Ｆ＋表示，雌性受体细胞没有Ｆ因子用Ｆ－表示。Ｆ因子决定的主要表型是细胞表面的性伞毛，它是细胞进行物理接触所必需的。Ｆ因子的DNA是环状的，大小约是细菌基因组DNA的2％，相对分子质量为4。5×106；长约94。5kb（1 kb=1000个碱基对），整个基因组编码94种蛋白质，其中1/3的基因与接合作用有关。
L。Cavalli…Sforza曾用氮芥气处理A菌，从中分离到一个突变株，当用这个突变株与B菌杂交时，重组体出现频率比A×B高出1000倍，他将这个菌株命名为高频率重组型Hfr（high frequency rebination）。后来发现Hfr就是F因子的DNA整合到细菌的染色体内的菌株。
因此，F因子能够以3种状态存在：①细菌细胞没有F因子，即F…；②包含一个自主状态的F因子，即F＋；③包含一个整合到自己染色体内的F因子，即Hfr（图5…20）。
图5…20 大肠杆菌F因子的3种状态
F＋×F…杂交 当把F＋和F…细菌混合培养时，几分钟内，不同类型的细胞间便形成接合桥（conjugation bridge）。结合桥是由F性伞毛形成的，它诱导F因子上traYz基因表达，产生核酸内切酶。该酶在oriT转移起点处一条单链上切开一个切口，F DNA以线状单链从5′末端开始向受体转移，互补链留在供体中。在37℃时，F DNA转移的速度约是每分钟104个核苷酸。同时，F＋和F…细胞内，以2条单链为模板，在DNA聚合酶Ⅲ参与下迅速合成双链DNA。F…细胞接受了F因子能迅速地复制并很快地扩散到原始的F…群体中，把它们为F＋（图5…21）。F因子从供体向受体的转移过程包括细胞间接触、接合管形成、单链断裂、单链DNA从供体向受体转移。在F＋×F…杂交中，虽然F因子以很高的频率转移，但供体染色体的传递则极少（只有10…6～10…7），由F因子带动的染色体基因转移只是个别和少数基因片段。如有连续的基因转移，可能是F＋群体中偶然存在Hfr变异所致。
图5…21 F＋×F…和Hfr×F…中F因子转移示意图
（a）在F＋×F…交配中，F因子从供体转移到受体细胞 （b）在Hfr×F…交配中，转移到
受体细胞中的F因子和细菌基因通过整合产生Hfr菌株
Hfr×F…杂交 Hfr是F因子插入到染色体上形成的菌株，F因子插入到染色体上的频率约为每代10…5～10…7。F因子的插入并不是随机的，在染色体上有许多特定的插入位点，它们与Ｆ因子上的插入序列有极大的同源性。Ｈfr×F…细菌杂交与F＋×Ｆ…有相同的Ｆ因子转移过程。当Hfr的细菌染色体进入F…后，在一个短时间内，对细胞中某些位点来说，是一段二倍体的DNA。这样的细菌称为部分二倍体（partial diploid）或部分合子（merozygote），其中来自供体的DNA称外基因子（exogenote），受体染色体则称为内基因子（endogenote）图（5…22a）。部分二倍体发生单数交换，会使环状染色体打开，产生一个线性染色体，使细胞不能成活。发生偶数次交换，才能产生遗传的重组体，外源基因才能整合到寄主的染色体并中使细菌染色体保持环状结构（图5…22c）。
图5…22 部分二倍体形成及单交换和双交换的后果
（a）部分二倍体形成 （b）单数次交换产生线状染色体 （c）双交换产生有活性
的重组子和片段。片段在以后的细胞分裂中丢失，所以不会出现相反的重组子
结合过程通常在DNA转移尚未完成时就己自行中断，但有时Hfr在结合桥断裂之前可将其整个染色体转移到受体细胞中，使受体细胞转变成Hfr。
5。4。1。3 中断杂交实验绘图
1957年E。Wollman和E。Jacob设计了著名的中断杂交试验（interrupted mating experi…ment）。试验中供试的Hfr菌株对链霉素敏感（strs），对叠氮化物有抗性（azir），对T1噬菌体有抗性（tomAr），对半乳糖（garl＋）和乳糖（lac＋）都是原养型。
Hfr菌株的基因型是strs azir tonAr tonAr gal＋ lac＋ 。
F…菌株的基因型是strr azis tonAs gal… lac… 。
他们将大约10倍的F…菌株与Hfr对数生长期细菌混合培养，每隔一定时间间隔取样，在食品搅拌器中剧烈振荡以中断杂交，分开已经紧密接合的供体…受体杂交对。然后将振荡后的培养物接种到含有链霉素的完全培养基上，杀死所有的Hfr细菌，以便选择结合后体即含有供体基因的抗链霉素的受体细菌。然后对形成菌落的F…细胞用影印法测试其基因型，结果见图5…23。从图中可以看到在接合作用开始后的9min，最早出现的重组体有10％含Hfr菌的azir基因，但几乎还没有tonAr、lac＋、gal＋基因。25min时，gal＋基因才出现。随着时间推移，从Hfr得到的某个等位基因重组体的百分率增加。如在11min时，tonAr首先在重组体中出现，15min后达到40％，25min后达到80％。其他即使增加时间，其重组百分数也不会改变。
图5…23 中断杂交后，重组体中Hfr遗传性状出现的频率
各标记基因进入F…细胞中的时间不同，达到最高水平的时间也不同
标记基因在受体细胞中出现频率完全取决于重组频率，而且Hfr菌株的基因是按一定的线性顺序依次进入F 细胞。由于每单位长度的染色体迁移之速度是保持不变的，因此，每个基因进入F…受体细胞的时间就给它们提供了遗传图距的尺度。离转移原点（orgin；O）越近，进入F…细胞越早，反之则晚。Wollman和Jacob曾把图5…23的实验结果绘制成直线连锁图：
O
F因子能够整合到染色体的许多位置，表5…3就是用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序。尽管每个菌株的基因转移顺序有所不同，但转移的顺序并不是随机的。例如，his基因都有gal在一边，gly在另一边。这种基因转移的差异就是由于各个Hfr菌株间F因子�
