普通遗传学-第36章
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蟛梗枰�4种酶协同作用共同完成修复。例如大肠杆菌中的uvrA突变体的修复过程需要4个步骤：①先由核酸内切酶识别DNA损伤部位，并在嘧啶二聚体两侧切开。内切酶种类很多，不同的内切酶具有相对特异性；②由核酸外切酶把嘧啶二聚体及邻近的一些核苷酸清除掉；③由DNA聚合酶修补缺口，合成一段新的核苷酸片段补在切除损伤的部位；④在连接酶的作用下，将新合成的DNA片段与原有链之间的缺口连接起来，使DNA恢复正常（图11…13）。
11。3。2。2 切除修复
有些DNA损伤太细微，普通的修复系统难以识别它，需要特异的切除修复途径，如AP核酸内切酶修复途径、DNA糖基化酶修复途径等。
AP核酸内切酶修复途径：当单个碱基自发脱落后形成的无嘌呤（apurinic）或无嘧啶（apyri…midimic）位点称为AP位点，细胞内存在一种核酸内切酶能对AP位点进修复。由于碱基的自发脱落是经常发生的，因此这种AP内切酶（AP endonuclease）是细胞所必需的。这种酶在AP位点切开磷酸二酯键，找断DNA链，启动由外切酶、DNA聚合酶I和DNA连接酶作用的切除修复过程。由于AP内切酶的有效性，它可能是其它修复途径的最后一步，只要损伤的碱基对能被切除留下一个AP位点，AP内切酶就能完成以后的修复过程。
DNA糖基化酶修复途径：DNA糖基化酶（DNA glycosylase）的作用是切开N…糖苷键，释放被饰变的碱基产生一个无嘌呤或无嘧啶AP位点，然后由AP内切酶修复系统修复。DNA糖基化酶有许多种，例如能识别和切除DNA中尿嘧啶的尿嘧啶DNA糖基化酶，识别和切除腺嘌呤脱氨基产物次黄嘌呤的糖基化酶，识别切除烷基化碱基（如3…甲基腺嘌呤、3…甲基鸟嘌呤、7…甲基鸟嘌呤等）的DNA糖基化酶等，目前仍有许多新的DNA糖基化酶正在不断被发现。
11。3。2。3 重组修复
切割修复使用互补链作为为模板，合成一条新的单链片段以替换损坏的DNA片段。但有时这种模板并不能随意得到。例如，当复制叉遇到损坏斑（如嘧啶二聚体）时，或在切割修复之前，双链DNA就已分开成单链时，一条单链中的损坏位点就不能得到修复。另外，如果互补碱基对的两个碱基发生变化，如由癌诱变剂丝裂霉素C引起的交叉连接，则两条链都不能作为对方的模板链。还有，当双螺旋齐头断裂，且双链片段完全丢失时，这种双螺旋就不能直接进行修复。在上述所有情况下，受损坏位点的遗传信息都丢失了，它们都只能从另一条具有相同序列的DNA分子上获得相应的DNA片段，否则就不能恢复到原状。这种修复机制称为重组修复（rebinational）。细胞中几乎始终存在与受损位点相应的DNA。例如当一个复制叉通过某条单链片段的损坏斑时，第二条DNA的子链就含有相同的序列。或者，如果两条单链都在未复制的区域被损坏，由于生长迅速的细菌细胞往往含有一个拷贝以上的染色体，因此这些染色体都可用作修复的模板。高等真核生物通常都是二倍体，在每一对同源染色体上都存相同或近乎相同的DNA序列。但是，重组修复的关键是需要一种酶将损坏斑一侧的序列并列到未损坏的DNA的相应序列上，使丢失了遗传信息的损坏部位与正常DNA的相应区域对应在一起。在大肠杆菌中，RecA蛋白就具有这种功能。
通常认为，交换是创造遗传变异的一种机制，可能交换的最重要的功能是修复损坏的DNA。在修复过程中，RecA蛋白首先与缺口结合，然后再诱导另一条同源双螺旋的一条单链填补到缺口上，使缺口得到修复（图11…14）。虽然DNA聚合酶能修补简单的缺口，但对一些结构复杂的如含有嘧啶二聚体的缺口来说，当复制叉遇到嘧啶二聚体时，由于不能进行碱基配对，复制机器必须越过受损坏的位点，重新启动复制过程，因此使该位点上两条单链上的遗传信息都丢失了。这些丢失的遗传信息只能通过与同源双螺旋进行重组而获得。
图11…15 影印培养法示意图
（a），（b），（c）添加不同营养物质的补充培养基 （d）基本培养基
RecA蛋白还能修复双链断裂的DNA分子。两个断裂末端先由外切核酸酶降解，产生单链末端，然后两个单链末端再分别侵入另一双螺旋的同源序列之中，形成两个连接点。另外，在启始修复合成之前，可能还需要另一种酶即RecBCD酶，这种酶通过与每一个游离的单链末端结合，为修复合成提供起始位点，然后再由DNA聚合酶修被缺口。当两个连接点被切割之后，两条亲本双螺旋分开，最后形成的缺刻再由DNA聚合酶修补和由DNA连接酶缝合。
11。3。2。4 错配修复
错配修复（mismatch repair）系统是通过识别并替换掉错误插入的碱基以改正DNA复制时的错误。该系统中的酶不仅要能识别错配的碱基对，而且在错配的碱基对中应能准确区别哪一个是正确的，哪一个是错误的，并将错误的碱基切除。错配修复系统主要是通过甲基化酶来区分模板链和新合成链，因为甲基化的DNA刚复制后两条链的甲基化状态不一样，只有在原亲本链上带有甲基，而新合成链则尚未甲基化，因此可以根据甲基化识别亲本链。这种修复系统只能识别DNA复制中出现的错配，因此也是一种复制后修复途径。
11。3。2。5 倾向差错修复
倾向差错修复（error…prone repair）是在DNA分子受到大范围损伤的情况下为防止细胞死亡而诱导出的一种应急修复措施，它是使细胞通过一定水平的变异以换取其生存的一种手段。它允许DNA合成进越过损伤部位，但DNA复制的保真度降低，造成错误的潜伏。由于这是一种细胞受到危急状态时的修复方式，有时便借用国际通用的紧急呼救信号（save our souls），称其为SOS修复。
倾向差错修复系统的确切作用机制目前还不很清楚，一般认为当DNA受到较大损伤，如产生许多嘧啶二聚体时，使后来正常的多聚酶催化的DNA复制进行到损伤部位时受到抑制。在短暂的抑制后，便能诱导产生一种新的DNA多聚合酶，它能催化损伤部位DNA修复合成。由于这种酶识别碱基的精确度较低，因此在新链的生长过程中，不仅在二聚体相对位置上可以出现任何碱基，而且在其他位置上也可能出现错配的碱基。虽然错配碱基可以被修复系统校正，但因数量较大，结果很容易产生突变。
11。4 基因突变的检出
基因突变一般可以通过它的表型效应而被察觉，但是当我们发现某一表型性状发生变化时还不能确定它是否由突变引起，还必须进行突变的测定才能确定。测定和检出突变的方法常因不同生物而异。
11。4。1 细菌营养缺陷型突变体的检出
在细菌的突变研究中，应用较多的是大肠杆菌。大肠杆菌正常野生型的合成能力很强，它能够在含有最低营养需要的基本培养基上生长繁殖，利用无机氮、葡萄糖和一些必需的无机盐类合成大量的有机物，例如氨基酸、酶的辅助因子、嘌呤、嘧啶和维生素等。这说明在大肠杆菌中存在着合成这些物质的基因，如果其中的某个基因发生了突变，其相应原某种物质就不能合成，从而产生营养缺陷型。由于这种营养缺陷型不能在基本培养基上生长，因此突变就很容易被发现，
并且大肠杆菌是单倍体，一旦发生任何突变就可以得到表现。只要通过简单的筛选检测技术就可以把即使很少的突变体分离鉴定出来。
对大肠杆菌营养缺陷型的检出方法很多，常用的有影印培养法和青霉素法。
11。4。1。1 影印培养法
先将诱变处理的大肠杆菌稀释后接种在完全培养基上进行培养，发生突变的营养缺陷型和没有发生突变的野生型都能在上面生长形成菌落。然后用一个直径略小于培养皿并包有丝绒的木块作为“印章”式的接种工具，经灭菌消毒后印在长有菌落的母板上，这时丝绒上便粘上了细菌。再把这种带有细菌的丝绒板分别印在基本培养基和在基本培养中补加不同营养物质的补充培养基上。在接种时应注意标记方向，经培养后比较分析，凡能在完全培养基上生长，而不能在基本培养基上生长，但能在某一补充培养基上生长的菌落都是营养缺陷型，并且是属于补充培养基中所补加营养物质的缺陷型（图11…15）。这种方法除了应用于大肠杆菌之外，也可以用于其他营养突变型的检出。
图11…15 影印培养法示意图
（a），（b），（c）添加不同营养物质的补充培养基 （d）基本培养基
11。4。1。2 青霉素法
青霉素法只适用于细菌。由于青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，因此细菌对青霉素是敏感的。但是只有处于生长增殖中的细菌对青霉素敏感，而处于休止状态的细菌对其则不敏感。当将诱变处理后的细菌培养在含青霉素的基本培养基上时，没有发生突变的野生型细菌可生长繁殖，因而能被青霉素杀死，发生突变的营养缺陷型突变体则不能在基本培养上生长而处于休止状态，结果不能被杀死而被保存下来。然后去除青霉素，并补加其他营养物质，使突变体生长形成菌落。再利用影印培养技术将它们分别接种在含不同营养物质的补充培养基上，就可以确定突变体为何种营养突变型。
11。4。2 真菌营养缺陷型突变体的检出
许多真菌与细菌一样，也能发生各种营养缺陷突变，并且在它们的生活周期中也都有单倍体时期，因此对真菌中发生的营养缺陷突变也能检测出来。例如链孢考霉营养缺陷突变体的检检出。先以X身线或紫外线照射纯型的分生孢子诱发突变，然后让诱变的分生孢子与野生型分生孢子交配产生分离的子囊孢子，并将它们放在完全培养基上培养。从完全培养基中取出一部分孢子在基本培养基上培养，若能正常生长说明没有发生突变，如果不能在基本培养基上生长，说明发生了突变，可进一步对其进行鉴定。为了鉴定突变的类型，把确定为发生突变的材料取出，分别接种在基本培养基和基本培养基加各种氨基酸、基本培养基加多种维生素等不同补充培养基上培养如果能在完全培养基上生长，不能在基本培养基上生长，但能在补加某种维生素的补充培养基上生长，说明是维生素的缺陷型。如果不能在基本培养基上生长，但能在含各种基酸的培养基上生长，说明是某种基酸的缺陷型。然后可将其在只含有某一种氨基酸的不同补充培养基上培养，以鉴定是哪一种氨基酸的缺陷型（图11…16）。
图11…16 链孢霉营养缺陷型的鉴定方法
1。野生型 2。与相对接合型的野生型杂交 3。完全培养基 4。 基本培养基
5～14。 添加不同营养物质的补充培养基 15。 基本培养基
（引自成盛祖嘉，略有改动）
另外，还可以用一种菌丝过滤法把突变型分离出来。其具体步骤是先将诱变处理的链孢霉分生孢子接种在液体基本培养基中，不断地给培养液通气刺激生孢子生长，防止它们彼此结合在一起。经过一天的培养分生孢子萌发长出菌丝。然后用棉花把萌发了的分生孢子过滤掉，没有萌发的分生孢子仍留在培养液中。这些没有萌发的分生孢子可能包括3种类型：一是需要较长时间才萌发的野生型分生孢子；二是已经突变为营养缺陷型的分生孢子，它们在基本培养液中不能萌发；三是已尼死了的分生孢子。以后每隔一定时间进行过滤，连续若干次之后，野生型分生孢子因不断萌发而被去掉，剩下的只是突变的或已死亡的分生孢子。最后利用各种补充培养基对突变的缺陷型分生孢子进行分析鉴定，从而确定它们是属于哪一类营养缺陷型（图11…17）。
图11…17 菌丝过滤法示意图
（引自宋运淳等，1990）
11。4。3 果蝇突变体的检出
H。J。Muller 从果蝇的自发突变中建立一系列品系用作检出奕变体的材料，其中最有名的是为检测X染色体上隐性致死突变而构建的CIB品系，后来他又CIB的基础上创建了Muller…5品系。L。V。Morgan采用并连X染色体法检测X染色体上的隐性非致死突变。此外还可以利用平衡致死品系检测常染色体上的突变基因。
例如，利用平衡致死品系检测果蝇第二染色体上的突变基因。一种果蝇平衡致死品系的第二对染色体中，一条染色体上带有显性翻翅基因Cy（Curly）是纯合致死的，同时有一个大的倒位；另一条染色体上具有显性星状眼基因S（Star），也是纯合致死的。该平衡致死品系只能通过杂合体保存，同时它也是一个倒位杂合体。利用这种平衡致死品系雌蝇与要检测的雄蝇杂交，在F中选择翻翅雄蝇再与平衡致死雌蝇交配产生第二代，然后在子二代中选择翻翅雌雄蝇互交获得子三代。如果最初雄蝇的第2染色体上不带有致死基因，在子三代中就有1/3左右的野生型；如果最初雄蝇的第2染色体带有致死基因，在子三代中则只有翻翅果蝇；若最初雄蝇第2染色体上带有隐性可见突变基因，则在子三代群体中除翻翅果蝇外，还有1/3左右的突变型（11…18）
11。4。4 植物突变体的检出
在植物中，当发现一种变异类型后，首先应将它与原始亲本材料在相同环境条件下种植，以确定其是否为可遗传变异，然后再作进一步分析。植物突变体的检出方法因植物和突变性状的种类而有所不同。
在种子植物中，最直接简便的突变体检出方法是利用直感现象检测种子性状的变异。例如，在玉米中，影响种子性状的某些突变很容易被发现。玉米籽粒胚乳为三倍体，它从母本的两个极核中接受了两套染色体，从父本的精核中接受了一套染色体。如果在精核所携带染色体上与胚乳某些性状有关的基因发生了突变，在受精后形成的籽粒中就能检出突变体。例如玉米籽粒的非甜质（Su）和甜质（su）性状，当籽粒成熟时非甜质籽粒饱满，而甜质籽粒表现皱缩，二者是很容易区别。如果以甜质纯玉米作母本，以诱变处理的非甜质玉米为父本授粉，若母本果穗上出现了甜质籽粒，就说明花粉中的非甜质基因su突变为甜质基因su，从而可检出甜质突变本。同样道理也可以检出甜质基因su突变为非甜质Su的突变体。其它表现种子直感现象的性状突变也能按此原理检出。
图11…18 用平衡致死系统检出果蝇常染色体上的基因变突
在禾谷类作物中，由于体细胞突变往往只发生在一个分蘖的幼芽或幼穗原基内，因而只影响到一个穗子或其中的少数籽粒。如果发生了隐性突变，还必须分穗、分株收获，按穗行、株行分别种植若干代，才能检出稳定的突变类型。例如，大麦诱发隐性突变的表现过程（图11…19）。通常将诱变处理的种子长成的植株称为M、M自交后工获得的子代用M表示，以此类推。假定在大麦的主茎穗中某些细胞发生了隐性突变（A→a），在M代的主茎穗行中一般会出现纯合突变体aa，其数量约为1/4，而其它穗行中不会出现变异。将M按穗行收获的各类单株，分别按株行种成M。在M中，其中有一行可能 全部个体表现正常，说明其上一代单株为AA型纯和体；其中一行可能全部个体为突变型，没有性状分离，它们是上一代隐性突变体aa的后代；另外其他株行中可能出现约1/4的个体表现突变性状，说明它们的上一代单株
