考博生化和分子生物学复习笔记-第7章
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碱基后RNA聚合酶才能有效结合。活化状态的基因表现 为：1。对核酸酶敏感；2。结合有非组蛋白及修饰的组蛋白；3。低甲基化。 （2）转录起始。最有效的调节环节，通过DNA元件与调控蛋白相互作用来调控基因表达。（3）转录后加工及转运。RNA编辑、剪接、转运。 （4）翻译及翻译后加工。翻译水平可通过特异的蛋白因子阻断mRNA翻译翻译后对蛋白的 加工、修饰也是基本调控环节。
（二）基因转录激活调节基本要素
1。DNA序列 原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。操纵子通常由2个以上的编码序列 与启动序列、操纵序列以及其他调节序列在基因组中成簇串联组成。启动序列是RNA聚合酶 结合并起动转录的特异DNA序列。多种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点 上游…10及…35区域存在一些相似序列，称为共有序列。大肠杆菌及一些细菌启动序列的共 有序列在…10区域是TATAAT，又称Pribnow盒（PribnowBox），在…35区域为 TTGACA 。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响RNA聚合酶与启动序列的结合及转录起 始。因此，共有序列决定启动序列的转录活性大小。操纵序列是原核阻遏蛋白的结合位点。 当操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或使RNA聚合酶不能沿 DNA向前移动，阻遏转录，介导负性调节。原核操纵子调节序列中还有一种特异DNA序列 可结合激活蛋白，使转录激活，介导正性调节。 顺式作用元件就是指可影响自身基因表达活性的DNA序列。在不同真核基因的顺式作用元 件中会时常发现一些共有序列，如 TATA盒、CCAAT盒等。这些共有序列就是顺式作用元 件的核心序列，它们是真核RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。顺式作用元件通常是非 编码序列。顺式作用元件并非都位于转录起点上游（5′端）。根据顺式作用元件在基因中的 位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，可将真核基因的这些功能元件分为启动子、 增强子及沉默子等。
2。调节蛋白 原核调节蛋白分为三类：特异因子、阻遏蛋白和激活蛋白。特异因子决定RNA聚合酶对一个 或一套启动序列的特异性识别和结合能力。阻遏蛋白可结合操纵序列，阻遏基因转录。激活 蛋白可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的结合，增强RNA聚合 酶活性。 真核调节蛋白又称转录因子。绝大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的 顺式作用元件相互作用（DNA…蛋白质相互作用）反式激活另一基因的转录，故称反式作用 因子。有些基因产物可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的开启或关闭， 这就是顺式作用。具有这种调节方式的调节蛋白称为顺式作用蛋白。
3。DNA…蛋白质、蛋白质和蛋白质相互作用 DNA…蛋白质相互作用指反式作用因子与顺式作用元件之间的特异识别及结合。这种结合通 常是非共价结合。绝大多数调节蛋白结合DNA前需通过蛋白质…蛋白质相互作用形成二聚体或多聚体。所谓二 聚化就是指两分子单体通过一定的结构域结合成二聚体，它是调节蛋白结合DNA时最常见 的形式。由同种分子形成的二聚体称同二聚体，异种分子间形成的二聚体称异二聚体。除二 聚化或多聚化反应，还有一些调节蛋白不能直接结合DNA，而是通过蛋白质一蛋白质相互 作用间接结合DNA，调节基因转录。
4。RNA聚合酶 DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节最终是由RNA聚合酶活性体现的。启动序列／启动 子的结构，调节蛋白性质对RNA聚合酶活性影响很大。 （1）启动序列或启动子与RNA聚合酶活性：原核启动序列或真核启动子是由转录起始点、 RNA聚合酶结合位点及控制转录的调节组件组成。会影响其与RNA聚合酶的亲和力，而亲 和力大小则直接影响转录起始频率。 （2）调节蛋白与RNA聚合酶活性：一些特异调节蛋白在适当环境信号刺激下在细胞内表 达，随后这些调节蛋白通过DNA…蛋白质相互作用、蛋白质…蛋白质相互作用影响RNA聚合 酶活性，从而使基础转录频率发生改变，出现表达水平变化。
（一）原核基因调节特点
1。σ因子决定mRNA识别特异性 原核生物细胞仅含有一种RNA聚合酶，核心酶参与转录延长，全酶司转录起始。在转录起始 阶段，σ亚基（又称σ因子）识别特异启动序列；不同的σ因子决定特异基因的转录激活，决定tRNA、mRNA和rRNA基因的转录。 2。操纵子模型的普遍性 3。阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性 （二）乳糖操纵子调节机制 1。乳糖操纵子的结构 大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β…半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转 移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因Ⅰ。Ⅰ基因编码一种阻遏 蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。在启动序列P上游还有一 个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点，由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成 LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
2。阻遏蛋白的负性调节 在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，Ⅰ基因列在P启动序列操纵下表达的 乳糖阻遏蛋白与O序列结合，故阻断转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋 白与O序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子β半乳糖苷酶、透酶生成。 当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催化、 转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数β…半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作为 一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录， 使β…半乳糖苷酶分子增加 1000倍。 3。CAP的正性调节 分解代谢物基因激活蛋白CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当 没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的 CAP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低， cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。 由此可见，对乳糖操纵子来说CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。两种调 节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。 4。对调节机制的解释 大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。 倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍 cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。 在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵 子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。
四、真核基因表达调控 （ 一）真核基因组结构特点 1。真核基因组结构庞大 哺乳类动物基因组DNA长达3×109个bp。 2。单顺反子 真核基因转录产物为单顺反子，即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条 多肽链。 3。重复序列 在原核、真核DNA中都有重复出现的核苷酸序列，但在真核更普遍。根据重复频率可将重 复序列区分为高度重复序列（106次）、中度重复序列（103～104）及单拷贝序列。单拷贝序列在整个基因组中只出现一次或很少的几次。 4。基因不连续性 真核结构基因两侧存在不被转录的非编码序列，往往是基因表达的调控区。在编码基因内部 尚有一些不为蛋白质所编码的间隔序列，称内含子，而编码序列称为外显子，因此真核基因是不连续的。 （二）真核基因表达调控特点 1。RNA聚合酶 真核RNA聚合酶有三种，即RNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ，分别负责三种RNA转录。TATA盒结合蛋 白为三种聚合酶所共有。 2。活性染色体结构变化 （1）对核酸酶敏感。 （2）DNA拓扑结构变化。 天然状态的双链DNA以负性超螺旋的构象存在。当基因活化 时，RNA聚合酶前方的转录区DNA拓扑结构为正性超螺旋，后面的DNA则为负超螺旋，正性超螺旋不仅阻碍核小体结构形成，而且促进组蛋白 H 2A ·H2B二聚体的释放，有利转录。 （3）DNA碱基修饰变化。在真核DNA有约5％的胞嘧啶被甲基化为5甲基胞嘧啶，甲基化范围与基因表达程度是反比关系。处于转录活化状态的基因CpG序列一般是低甲基化的。 （4）组蛋白变化。 ①H1样组蛋白减少。②H 2A ·H2B二聚体不稳定性增加。③组蛋白修 饰：最常见的修饰有乙酰化、泛素化，修饰后使核小体结构变得不稳定。④H3组蛋白巯基 暴露。 3。正性调节占主导 提高了蛋白…DNA相互作用的指导性，经济有效。4。转录与翻译间隔进行 真核细胞有细胞核及胞浆等区间分布，转录与翻译在不同亚细胞结构中进行。 5。转录后修饰、加工
（三）真核基因转录激活调节 ☆ 1。顺式作用元件 顺式作用元件是特异转录因子的结合位点，按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动 子、增强子及沉默子。
（1）启动子。真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，每一组件 含7－20bp的DNA序列。启动子包括至少一个转录起始点，以及一个以上的功能组件。在这些功能组件中最具典型意义的就是TATA盒，TATA盒通常位于转录起始点上游…25至 30bp，控制转录起始的准确性及频率。典型的启动子由TATA盒及上游的CCAAT盒和（ 或）GC盒组成，这类启动于通常具有一个转录起始点及较高的转录活性。然而，还有很多 启动子并不含TATA盒，这类启动子分为两类：一类为富含GC的启动子，最初发现于一类管 家基因，这类启动于包括一个或数个分离的转录起始点；另一类启动子既不含TATA盒，也 没有GC富含区，这类启动子可有一个或多个转录起始点，但多数转录活性很低或根本没有 转录活性，而是在胚胎发育、组织分化或再生过程中受调节。
（2）增强子 是远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启 动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关，可位于转录起始点 的上游或下游。从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时， 增强子也无法发挥作用。
（3）沉默子某些基因含有负性调节元件沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因 转录起阻遏作用。
☆2。转录调节因子 （1）转录调节因子分类。两类：①基本转录因子是RNA聚合酶结合启动子 所必需的一组因子，为所有mRNA转录起动共有②特异转录因子为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达，包括转录激活因子和抑制因子。（2）转录调节因子结构。所有转录因子至少包括两个结构域：DNA结合域和转录激活域； 此外，很多转录因子还包含一个介导蛋白质…蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化 结构域。①DNA结合域通常由60－100个氨基酸残基组成。最常见的DNA结合域结构形式 是锌指结构和碱性α螺旋。类似的碱性DNA结合域多见于碱性亮氨酸拉链和碱性螺旋…环…螺 旋。②转录激活域——由30…100个氨基酸残基组成。根据氨基酸组成特点，转录激活域又 有酸性激活域、谷氨酰胺富含区域及脯氨酸富含区域。③介导二聚化的结构域——二聚化作 用与亮氨酸拉链、螺旋…环…螺旋结构有关。 3。mRMA转录激活及其调节 真核RNA聚合酶Ⅱ不能单独识别、结合启动子，而是先由基本转录因子TFⅡD组成成分TBP 识别TATA盒或启动元件，并有TFⅡA参与结合，形成TFⅡD…启动子复合物；继而在TGⅡ AF等参与下，RNA聚合酶Ⅱ与TFⅡD、TFⅡB聚合，形成一个功能性的前起始复合物。在 几种基本转录因子中，TFⅡD是唯一具有位点特异的DNA结合能力的转录因子，在上述有 序的组装过程起关键性指导作用。这样形成的前起始复合物尚不稳定，也不能有效启动 mRMA转录。然后由结合在增强子上的转录激活因子直接或间接与TFⅡD结合，从而影响 前起始复合物的形成、稳定性以及RNA聚合酶的活性。
◆克隆与克隆化 所谓克隆就是指同一副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化。为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多 相同分子的集合，即为分子克隆。
2。DNA克隆 是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因 转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。
3。工具酶（1）限制性内切酶（2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段 （3）DNA聚合酶Ⅰ：a。合成双链cDNA中第二条链。 b。缺口平移制做探针。 c。DNA序列分析。 d。填补3′末端。 （4）Taq酶催化PCR反应，聚合DNA （5）反转录酶a。合成cDNA。b。替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析 （6）多聚核苷酸激酶催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针 （7）碱性磷酸酶切除DNA5′末端磷酸基 （8）末端转移酶在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾。（9）DNA酶：切割DNA （10）RNA酶：切割RNA。
★ 重组DNA的基本原理 ①目的基因的获取，②基因载体的选择与构建，③目的 基因与载体的拼接，④重组DNA分子导入受体细胞，⑤筛选并无性繁殖含重组分子的受体 细胞（转化子）。
（一）目的基因的获取1。化学合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该 多肽编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 2。基因组DNA：采用物理方法（剪切或超声波）或限制性内切酶将染色体DNA切割成许多片 段，继而将它们与适当克隆载体结合，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带 一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全 部信息，即基因文库。建立基因文库后，结合适当筛选方法从众多的转化子菌株中选出含某 一基因的菌株，扩增分离得到目的基因。 3。 cDNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链 cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库。用适当方法cDNA文库中就 可以筛选分离到目的基因。 4。聚合酶链反应：在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向DNA合成体系中引入热稳定的 Taq DNA聚合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶 促合成，使目的基因按指数增长。
（二）克隆载体的选择与改建 1。质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链DNA分子，可独立自主进行复制，含筛 选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。 2。噬菌体：egλ噬菌体、MB载体 3。柯斯质粒与酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。 4。病毒载体。
（三）外源基因与载体的连接 即DNA的体外重组。这
