考博生化和分子生物学复习笔记-第8章
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酵母人工染色体载体：用于插入大DNA片段。 4。病毒载体。
（三）外源基因与载体的连接 即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA酶将外源DNA与载体共价连接的。1。粘性末端连接（1）同一限制酶切割位点连接由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在 DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。 （2）不同限制酶切割位点连接由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同 类型的粘性末端，即配对末端，也可以进行粘性不同末端连接。 2。平端连接 3。同聚物加尾连接 同聚物加连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移 酶作用下，在DNA片段制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。 4。人工接头连接
（四）重组 DNA导入受体细胞 根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同手 段。 1。感受态细胞。经一定方法处理（如CaCl2处理）后具备接受外界DNA能力的大肠杆菌。受体 菌应为安全无毒菌株，且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。 2。转化、转染及感染。本定义不涉及真核细胞，只针对大肠杆菌。 转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入受体细胞。 转染：以噬菌体为载体，用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体 菌。 感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。
（五）重组体的筛选 1。直接选择法 直接法是针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直接测 定基因表型。 （1）抗药性标志选择：如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因，则只有含这种抗药基因 的转化子细菌才能在含该抗菌药物的培养板上幸存并形成菌落。 （2）标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补， 那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救筛选。 （3）分子杂交法 2。免疫学方法 应用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，属非直接选择法。特异性强、灵敏度 高，适用于选择不为宿主菌提供任何标志的基因。
（六）克隆基因的表达
1。原核表达体系 大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：①含大肠 杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子③含适当的翻译控制序 列和翻译起始点等④含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正 确衔接表达产物的分离、纯化。 大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的 cDNA，不宜表达真核基因组DNA②由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不 能形成适当的折叠或进行糖基化修饰③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有 活性尚需进行复杂的复性处理④很难表达大量的可溶性蛋白。
2。真核表达体系 与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优 势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA； 将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡 聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。
三、重组DNA技术与医学的关系 1。疾病基因的发现 通过对基因研究认识疾病分子机制的一个典型例子是脆性X综合症。 2。发展生物制药 3。 DNA诊断 DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病 所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 4。基因治疗 所谓基因治疗就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补充基因缺陷，从而达到治疗的目的。 5。遗传病的预防 （1）产前诊断。 （2）携带者测试。 （3）症候前诊断。 （4）遗传病易感性。
生物化学 分子生物学 考研复习经典笔记 /
★ 癌基因、抑癌基因与生长因子考点： 癌基因的定义，原癌基因四大特点，原癌基因激活的四大机制，原癌基因的四大类产物； 抑癌基因的定义。两种抑癌基因Rb和P53的定位，结构、转录产物性质及其作用机制。 重点： 原癌基因的定义、作用、活化机制。抑癌基因的定义，Rb和P53的作用机制。 难点： 病毒癌基因的形成及其与逆转录病毒生活周期的关系。原癌基因的活化机制：获得启动子与 增强子、基因易位。Sis基因表达产物的作用机制及其与相关细胞信号传导通路的联系。 Rb蛋白的磷酸化形式与细胞周期及其作用机制的关系，Rb蛋白如何与转录因子E …2F 作 用。 P53蛋白的结构和功能的关系。 一、癌基因概述 癌基因最初的定义是可以在体外引起细胞转化、在体内引起癌瘤的一类基因，病毒中存在着 癌基因，统称为病毒癌基因，各种动物细胞基因组中普遍存在着与病毒癌基因相似的序列， 统称为细胞癌基因。由于细胞癌基因在正常细胞中以非激活形式存在，故又称为原癌基因。
原癌基因的特点可概括如下：（1）广泛存在于生物界中，从酵母到人的细胞普遍存在。（2）在进化进程中，基因序列呈高度保守性。（3）它的作用是通过其表达产物蛋白质来体现的；它们的存在对正常细胞不仅无害，而且 对维持正常生理功能、调控细胞生长和分化起重要作用，是细胞发育、组织再生、创伤愈合 等所必需。（4）在某些因素（如放射线、某些化学物质等）作用下，一旦被激活，发生数量上或结构 上的变化时，就会形成癌性的细胞转化基因。
二、常见的癌基因家族 （一）src家族 它们都含有相似的基因编码结构，产物具有使酪氨酸磷酸化的蛋白激酶活性，定位于胞膜内面或跨膜分布。 （二）ras家族 家族成员基因序列差异大，但所编码的蛋白质是P21，位于细胞质膜内面，P21可与GTP结 合，有GTP酶活性，并参与cAMP水平的调节。 （三）myc家族 编码核内DNA结合蛋白，有直接调节其他基因转录的作用。 （四）sis家族 只有sis基因一个成员，编码P28，与人血小板源生长因子结构类似，刺激间叶组织细胞分 裂增殖。 （五）myb家族 编码核蛋白，能与DNA结合，为核内的一种转录因子。
三、癌基因活化的机制 （一）获得启动子与增强子。当逆转录病毒的长末端重复序列（含强启动子和增强子）插入原 癌基因附近或内部时，启动下游基因的转录，导致癌变。 （二）基因易位—染色体易位重排，导致原来无活性的原癌基因移至强启动子或增强子附近 而活化。 （三）原癌基因扩增 原癌因扩增是原癌基因数量的增加或表达活性的增加，产生过量的表达蛋白也会导致肿瘤的 发生。 （四）点突变 原癌基因在射线或化学致癌剂作用下，可能发生单个碱基的替换——点突变，从而改变了表 达蛋白的氨基酸组成，造成蛋白质结构的变异。
四、原癌基因的产物与功能 原癌基因编码的蛋白与细胞生长调控的许多因子有关，这些因子参与细胞生长、增殖、分化 途径上环节的调控。将癌基因表达产物按其在细胞信号传递系统中的作用分成以下四类： （一）细胞外的生长因子 细胞外信号包括：生长因子、激素、神经递质、药物等，它们作用于细胞膜上的受体系统或直接被传递至细胞内，再通过多种蛋白激酶活化，对转录因子进行磷酸化修饰，引发一系列 基因的转录激活。例如，sis基因编码产物
（二）跨膜的生长因子受体 另一类原癌基因的产物为跨膜受体，它能接受细胞外的生长信号并将其传入胞内。跨膜生长 因子受体有胞质结构区域，并具有酪氨酸特异的蛋白激酶活性。例如C…Src、C…abl另一些 癌基因所编码的激酶不是在酪氨酸上磷酸化，而是使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化。通过这种 磷酸化作用，使其结构发生改变，增加激酶对底物的活性，加速生长信号在胞内的传递。
（三）细胞内信号传导体 生长信号到达细胞后，借助一系列胞内信息传递体系，将接受的生 长信号由胞内传至核内，促进细胞生长。胞内信号传递体系成员多是原癌基因的成员，或通 过这些基因产物的作用影响第二信使。例如，非受体酪氨酸激酶（c…crl、c…bal等），丝/苏氨 酸激酶（c…ras，c…mas），ras蛋白（H…ras、K…ras和N…ras等）及磷脂酶（crk产物）。
（四）核内转录因子 已知某些癌基因表达蛋白（如myc、fas等）定位于细胞核内，它们能与靶基因的调控元件结 合直接调节转录活性起转录因子作用。这些蛋白通常在细胞受到生长因子刺激时迅速表达， 促进细胞的生长与分裂过程。c…fos是一种即刻早期反应（立早）基因。在生长因子、佛波 酯、神经递质等作用下，c…fos能即刻、短暂表达，作为传递信息的第三信使。
◆五、抑癌基因 一类抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。抑癌基因的丢失或失活可能导致肿瘤发生。
（一）视网膜母细瘤基因（Rb基因） Rb 基因是最早发现的肿瘤抑制基因，最早发现于儿童的视网膜母细胞瘤，因此称为Rb基 因。当Rb基因一旦丧失功能或先天性缺乏，视网膜母细胞则出现异常增殖，形成视网膜母 细胞瘤。Rb基因失活还见于多种肿瘤，具有一定的广泛性。 Rb基因比较大，编码蛋白质为P105，定位于核内，有磷酸化和非磷酸化两种形式，非磷酸 化形式称活性型，能促进细胞分化，抑制细胞增殖。 Rb基因对肿瘤的抑制作用与转录因子（E－ 2F ）有关。E …2F 是一类激活转录作用的活性 蛋白，在G0、G1期，低磷酸化型的Rb蛋白与E－ 2F 结合成复合物，使E－ 2F 处于非活 化状态；在S期，Rb蛋白被磷酸化而与E－ 2F 解离，结合状态的E …2F 变成游离状态，细 胞立即进入增殖阶段。当Rb基因发生缺失或突变，丧失结合、抑制E …2F 的能力，于是细 胞增殖活跃，导致肿瘤发生。
（二）P53 基因 野生型P53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖中起着重要作用，P53基因时刻监控着 基因的完整性，一旦细胞DNA遭到损害，P53蛋白与相应基因的DNA部位结合，起特殊转录因子作用，活化P21基因转录，使细胞停滞于G1期；抑制解链酶活性；并与复制因子A相 互作用参与DNA的复制与修复；如果修复失败，P53蛋白即启动程序性死亡过程诱导细胞自 杀，阻止有癌变倾向突变细胞的生成，从而防止细胞恶变。 当P53发生突变后，不单失去野生型P53抑制肿瘤增殖的作用，而且突变本身又使该基因具 备癌基因功能。
六、生长因子 （一）概述 调节细胞生长与增殖的多肽类物质称为生长因子。 根据生长因子产生细胞与接受生长因子作用的细胞相互之间的关系，可概括为以下三种模 式： ①内分泌，生长因子从细胞分泌出来后，通过血液运输作用于远隔靶细胞。如：血小板源生 长因子源于血小板作用于结缔组织。 ②旁分泌，细胞分泌的生长因子作用于邻近的其他类型细胞，对合成、分泌该生长因子的自 身细胞不发生作用，因为它缺乏相应受体。 ③自分泌，生长因子作用于合成及分泌该生长因子的细胞本身。生长因子以后两种作用方式为主。 （二）生长因子的作用机制 生长因子由不同的细胞合成后分泌，作用于靶细胞上的相应受体，这些受体有的是位于细胞膜上，有的是位于细胞内部。位于膜表面的受体是跨膜的受体蛋白，包含具有酪氨酶活性的 胞内结构域。当生长因子与这类受体结合后，受体所包含的酪氨酸激酶被活化，使相关蛋白 磷酸化。另一些膜上的受体则通过胞内信息传递体系，产生相应的第二信使，后者使蛋白激 酶活化，活化的蛋白激酶同样可使胞内相关蛋白质磷酸化。这些被磷酸化的蛋白质再活化核 内的转录因子，引发基因转录，达到调节生长与分化的作用。 另一类生长因子受体定位于胞液。当生长因子与胞内相应的受体结合后，形成生长因子…受 体复合物，后者亦可进入细胞核活化相关基因促进细胞生长。
★ 基因诊断与基因治疗 考点： 基因诊断的定义及常用技术方法； 基因治疗的定义、采用方法和基本程序。 基因诊断的概念和特点。基因诊断的常用技术方法：常用方法有①核酸分子杂交技术，包括 限制性内切酶酶谱分析法、DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析、等位基因特异寡核 苷酸探针（ASO）杂交法。②PCR。③基因测序。 基因治疗的概念和常用方法：常用方法有基因矫正、基因置换、基因增补、基因失活、引入自杀基因。 难点： 基因诊断的方法及其原理，基因治疗载体的选择。
一、基因诊断 （一）基因诊断的概念和特点 所谓基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表 达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基因诊断的特点：①以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。②分子 杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高的特异性。③分子杂交和聚合酶链反应都具 有放大效应，诊断灵敏度很高。④适用性强，诊断范围广，检测目标可为内源基因也可为外 源基因。
（二）基因诊断的常用技术方法 1。核酸分子杂交技术 以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。常用有以下方法。 （1）限制性内切酶分析法。 此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存 在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异 的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。 （2）DNA限制性片断长度多态性分析。 在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变 异（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少 DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片断， 称为限制性片段长度多态性（RFLP）。RFLR按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某 一致病基因与特异的多态性片断紧密连锁，就可用这一多态性片段为一种“遗传标志”，来判 断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。甲型血友病、囊性纤维病变和苯丙酮尿症等均 可借助这一方法得到诊断。 （3）等位基因特异寡核苷酸探针杂交法。遗传疾病的遗传基础是基因序列中发生一种或多 种突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一是相应于突 变基因碱基序列的寡核苷酸；二是相应于正常基因碱基序的寡核苷酸，用它们分别与受检者 DNA进行分子杂交。从而检测受检者基因是否发生突变，以及是否有新的突变类型。2。聚合酶链反应（PCR） PCR技术采用特异的引物，能特异地扩增出目的DNA片段。由于在基因顺序中突变区两侧 的碱基序列和正常基因仍然相同。因此。根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物， 经PCR反应将目的基因片断扩增出来，即可进一步分析判断
