诊断学第七版教材-第93章
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况下，用放射性核素或非放射性核素标记的探针与细胞内的DNA或RNA进行杂交。若
探针是同位素标记，杂交后需用X光片进行放射自显影，然后观察曝光点在组织或染色体
分裂象上的相对位置。若探针用荧光标记，杂交后用荧光显微镜直接观察，现已发展了多
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色荧光技术，因此可同时检测多种DNA或RNA的情况。原位杂交由于是原位检测，因
此在对特定DNA或RNA进行检测的同时还可对其进行细胞及基因组内定位。
（二）DNA测序
DNA测序（DNA seq？aenc…ing）即DNA一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要
的技术。由于临床上进行各种突变分析的最终目的是获得突变信息，即确定具体的突变类
型，因而不管先通过何种方法进行突变筛查，最终都会落实到DNA测序上。DNA测序能
直观地反映出DNA序列的变化，因此是诊断未知突变基因的最直接的方法，在遗传病和
肿瘤的诊断、法医学的鉴定中具有非常重要的意义。DNA序列测定常用方法有以下3种：
1．双脱氧链终止法 目前应用最多的快速测序技术是Sangei‘等1977年提出的双脱氧
链终止法（chain termination melthod）。双脱氧链终止法的基本原理是：DNA聚合酶利用
单链DNA作为模板，准确合成互补DNA链，它不仅可以以单脱氧核苷酸（dNTP）为底
物，而且可以以双脱氧核苷酸（ddNTP）为底物，ddNTP若在合成过程中3 L末端掺入了
ddNTP，DNA链的生长将会被终止，因此生成一系列不同长度的DNA片段。其基本操
作步骤‘（图4—10一1）：共设4个反应管，各管中同样加入DNA模板、DNA聚合酶、放射
性核素szP标记的引物、4种dNTP，将四种不同的ddNTP（ddATP、ddTTP、dd（＇TP、
dd（：TP）分别加入相应管进行温育，将四管反应产物平行加到同一变性凝胶上作电泳分
离，通过放射自显影术可获得一系列全部以3，_末端ddNTP为终止碱基的长度不等的
DNA片段的电泳谱带，通过电泳谱带可直接读出DNA的核苷酸顺序。
图4—10一1 双脱氧链终止法DNA测序
2．化学降解法 化学降解法（chemical degradation seqLlencing）由Maxam&Gibert
于1977年提出，其原理是不同的碱基（G，A＋G，C＋T，C）可被不同的化学试剂特异
地修饰，使相应的糖苷键变得不稳定，造成碱基的特异性切割，产生四组不同长度的
DNA链的反应混合物，反应后经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影也可读出DNA的序
列。常用的化学试剂有硫酸二甲酯和肼。化学降解反应包括碱基的修饰、将修饰的碱基从
其糖环上脱落、DNA在失去碱基的糖环处断裂。化学法的优点是模板不需体外酶促反应，
只要末段标记的DNA片段，无论单链或双链，分别标记3’端和5’端可进行双侧读取检测
短的寡核苷酸片段；其缺点是方法复杂费时，末段标记比活性低。
3．自动测序技术 自动测序技术采用自动化测序仪进行，其原理同双脱氧链终止法。
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故其作为一种有效的 扩增和检测技术具有很好的发展前毒：“。驯兀哥。w以进z甲’
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（五）单链构象多态性分析
单链构象多态性（single strand conformational polymorphism，SS（：P）分析是一种分
析突变基因的方法。其基本原理是单链DNA在非变性的情况下具有一定的空间构象，这
种构象是由于DNA内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当DNA中一个碱基突
变时，其空间构象会发生改变，空间构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进
行电泳时受到的阻力不同，因此通过非变性凝胶电泳可将构象不同的分子分离开，从而对
突变基因进行检测。现SS~：P多与PCR技术联用（PCR—SS（：P）检测基因突变，提高了
基因突变检测的灵敏性，现已广泛用于遗传病及肿瘤基因的分析。
（六）限制性片段长度多态性分析
限制性片段长度多态性（restriction fragment length p01ymorphism，RFLP）分析是
限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针一杂交技术的综合应用，多用于临床遗传性疾
病的基因诊断。其基本原理是限制性内切酶可特异识别DNA碱基序列并对其进行切割
（如EcoR工识别GAATTc序列并对其进行切割），当碱基发生改变时（如遗传性疾病、
肿瘤等多有基因的缺陷），造成新酶切位点的形成或旧酶切位点的消失等，从而引起限制
性内切酶酶切后的DNA片段长度差异，称限制性片段长度多态性。RFLP作为第一代遗
传标记已经广泛地应用于遗传病的连锁分析。根据这些广泛存在的遗传标记，应用定位克
隆策略已成功地确定了100多种以孟德尔遗传方式为主的遗传病基因。同时，RFLP还可
用于基因组同源性分析以及个体识别，后者在法医学中已成为常规手段和方法。
（七）单核苷酸多态性分析
单核苷酸多态性（single nucleot：ide．polymorphis，SNP）主要是指在基因组水平上由
单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，
在人群中的发生率大于1％。SNP有单碱基的转换、颠换、插入、缺失等形式，但更多的
是单个碱基的置换。现今，人们认为基因组中的这类多态性有助于解释个体间的表型差
异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病易感性的差异，以及对各种药物的耐受性
和对环境因素反应不同。SNP作为一种遗传标记具有以下特性：
（1）密度高：它在基因组中的分布比微卫星标记广泛，可以在任何一个待研究基因的
内部或附近提供一系列标记。
（2）具有代表性：某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质的结构或表达水
平，因此它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点，可能代表疾病遗传机理中的某
些作用因素。
（3）遗传稳定性：与微卫星等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性，
尤其是处于编码区的SNP（cSNP）。SNP一般只有2个等位基因，即是二态的，故又称双
等位基因标记（bialleic：marker…），其在任何人群中的等位基因频率都可估计出来。
（4）分析易实现自动化：由于SNP是双等位基因标记，容易进行自动化批量检测，
分析也相对简单，不需要像检测RFLP及微卫星多态标记那样进行片段长度的测量。缩短
了研究时间。目前已有多种方法可用于sNP检测，如根据DNA阵列的微测序法、动态等
位基因特异杂交、寡聚核苷酸特异连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。不管哪一种方
法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其他检测。
（八）基因芯片技术
基因芯片（gene chip）通常指DNA芯片，其基本原理是将大量已知的寡核苷酸分子
固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中
靶分子的数量。基因芯片技术集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子
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合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术，使基因芯片具有微型化、集约化和标准
化的特点，实现了对靶基因快速、高通量的检测。
基因芯片在医学领域中具有广阔的应用前景。①在优生方面：目前知道有600多种遗
传疾病与基因有关。妇女在妊娠早期用DNA芯片做基因诊断，可以避免许多遗传疾病的
发生。②在疾病诊断方面：由于大部分疾病与基因有关，而且往往与多基因有关，因而，
利用DNA芯片可以对一些疾病进行诊断。③在器官移植、组织移植、细胞移植的基因配
型方面：如可用于HLA分型。④病原体诊断：如细菌和病毒鉴定、耐药基因的鉴定。
⑤在环境对人体的影响方面：已知花粉过敏等人体对环境的反应都与基因有关。⑥在法医
学方面：DNA芯片比早先的DNA指纹鉴定更进一步。
四、基因诊断在临床医学中的应用
（一）遗传性疾病的基因诊断
遗传性疾病往往有基因突变或存在连锁不平衡，因此可以通过基因突变检测技术或利
用DNA多态性连锁分析对遗传性疾病作出诊断。如：镰刀状红细胞贫血、血友病、地中
海贫血、脆性x综合征等均可应用分子生物学技术对其进行基因诊断。下面以a地中海贫
血（简称a地贫）为例，说明基因诊断在遗传性疾病诊断中的作用。a地贫是由于a链基
因的完全或部分缺失所致的a珠蛋白合成减少的血红蛋白病。首先可从DNA水平进行诊
断：过去是从羊水细胞中提取DNA，用标记的a珠蛋白探针通过液相杂交技术对a珠蛋
白基因缺失的程度进行检测。但液相杂交技术不够灵敏，现多采用限制性内切酶酶谱分析
技术，通过观察酶切图谱条带来进行诊断，若正常条带消失或出现异常条带，则表明由a
珠蛋白基因的改变（如缺失、突变等），从而对其进行诊断。从RNA水平进行诊断：由于
a珠蛋白基因的改变，导致a珠蛋白mRNA含量减少，因此可以应用RT—PCR的方法检
测患儿红细胞中a的珠蛋白mRNA，从而对a地贫进行诊断。
（二）感染性疾病的基因诊断
过去常采用形态学、生化学及血清学的方法对感染性疾病进行诊断，但由于痫原体侵
入人体后需潜伏一定时间后才会出现抗体或生化方面的改变，因此血清学和生化学方法很
难对其进行及时的诊断。感染性疾病确诊的方法需要从细胞、血液或分泌液中分离培养出
病原体，这些方面复杂、费时。基因诊断灵敏度高，克服了传统方法的不足，病原体侵入
机体初期就能被检测到，且可对病原体基因进行定量，从而判断该病原体是否处在复制
期，还可帮助临床医生监测治疗药物的疗效。应用分子生物学的方法不仅可以检测DNA
病毒，还可以检测RNA病毒。目前可检出的病原体有：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、
人乳头瘤病毒、柯萨奇病毒、EB病毒、疱疹病毒、结核分枝杆菌、产毒性大肠杆菌、奈
瑟淋球菌、肺炎支原体、疟原虫、利什曼原虫、白色念珠菌等。
（三）肿瘤的基因诊断
肿瘤的形成是遗传因素与环境因素相互作用的结果，随着肿瘤分子生物学的发展，人
们对肿瘤的认识已经发展到基因水平，发现了许多肿瘤相关基因，对癌基因、原癌基因和
抑癌基因有所了解。
（1）癌基因：是指能参与或直接导致细胞发生恶性转化的基因。癌基因可分为两大
类：一类是肿瘤非特异性癌基因，如H—ras、K—ras、c—myc等基因，在肝癌、肺癌、结直
肠癌等许多肿瘤中可检测到；第二类是肿瘤特异性癌基因，如C属于非特异性癌基因；c…sis
与淋巴结肿瘤转移有关，c…abl与慢性髓性白血病有关。
（2）原癌基因：指存在于正常细胞内，在一定的因素刺激下可转变为癌基因的基因序
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列。其编码的产物可在细胞膜、细胞质、细胞核和细胞外。
（3）抑癌基因：是一类抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。抑癌基因
的丢失或失活可能导致肿瘤发生。如野生型P53为抑癌基因，当其发生点突变、插入突
变、缺失突变时将会失去抑癌的作用，它的失活对于肿瘤的形成具有重要的作用。迄今为
止发现许多肿瘤中存在P53基因的突变，如肝癌、胃癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤等。随
着分子生物学技术的发展，我们可以应用分子生物学技术检测肿瘤相关基因，从而对癌症
进行早期诊断、对其组织学的恶性程度进行判断等。
（四）基因诊断在法医学中的应用
1983年Jeffreys等在人体基因组DNA中发现了高度可变的小卫星区域，同一个体不
同组织来源的DNA被同一酶降解后的Solnhern印迹图上的条带完全一样，而不同个体之
间（除非同卵双生）的谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因此这种
SouIthei…n印迹图被称为DNA指纹。法医学常将此种技术用于刑事案件中的物证来源进行
鉴定和民事案件中的亲子鉴定。
第二节 流式细胞术及其临床应用
一、流式细胞术
流式细胞术（flow cytomet：ry，FcM）是一种集细胞生物化学技术、单克隆抗体技术、
激光技术、流体力学、电子技术、计算机技术、分子生物学、临床医学等理论于一体的现
代分析技术；能够对细胞或微球的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功
能状态等进行定性或定量检测，并在必要时进行分类收集的多参数检测细胞分析技术，使
用的是流式细胞仪（flow cytometry）。
二、流式细胞仪组成及其工作原理
流式细胞仪由流动室及液流驱动系统、激光光源及光束形成系统、光电检测及信息处
Ill 理系统和细胞分离纯化系统等部分组成。经染色的
激光 细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦
＼观测点 点，单个细胞在高压氧压力下流速极快，每秒可通
过5000～10 000个细胞。当细胞或微球经过焦点
时，发出一束散射光和（或）荧光，并经过滤光镜
系统收集到达一个光电检测器（光电倍增管或一个
板 固态装置），光检测器把光信号定量转化成电信号，
经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电
子存储数据（图4—10一2）。数据可以调出，并以直
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三、流式细胞术的临床应用
近年来，随着流式细胞仪性能的不断改进、测定方法与技术的迅速发展、高质量试剂
的研制，使得流式细胞技术已在基础医学、临床医学及科学研究中有着广泛的应用。尤其
是流式细胞仪迅速进入临床实验室，一些检验项目已成为辅助临床疾病诊断、选择治疗方
案、预后判断等方面的重要手段。
（一）免疫学
利用FCM可进行免疫活性细胞的分型与纯化、淋巴细胞亚群与疾病关系的分析；免
疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。
流式细胞膜免疫表型分析是流式细胞技术最主要的分析内容之一，很多细胞亚群的检
测均是以膜免疫表型为主，如T、B淋巴细胞和NK细胞分析等。
流式细胞技术可对混合细胞群体中亚群细胞进行分类检测，如淋巴细胞可依其表面标
志的不同分为T淋巴细胞（CD3’）、B淋巴细胞（CDl9。）、NK细胞（CD3一／CDl6。56’），
T淋巴细胞又可进一步分为辅助／诱导T淋巴细胞（CD3’／CD4’／CD8一）和抑制／细胞毒T
淋巴细胞（CD3’／CD4一／CD8’）等。目前淋巴亚群细胞分类多以相对百分比表达结果，但
由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例，并不能体现在单位体积血液
中的绝对数量，而临床一些疾病的诊断需要考虑细胞的绝对数量，如艾滋病患者的血液中
辅助／诱导
